Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique sur blessure tout en induisant en vivo reprogrammation. Cette méthode convient pour évaluer le rôle de la sénescence cellulaire au cours de la régénération tissulaire et reprogrammation in vivo.

Résumé

Sénescence cellulaire est une réaction de stress qui se caractérise par un arrêt de la croissance cellulaire stable, ce qui est important pour de nombreux processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer et le vieillissement. Récemment, la sénescence a également été impliquée dans la régénération et la réparation des tissus. Par conséquent, il est devenu plus en plus critique pour identifier les cellules sénescentes en vivo. Associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-Gal) dosage est le dosage plus largement utilisé pour détecter les cellules sénescentes en culture et in vivo. Cette analyse est basée sur le contenu lysosomal accru dans les cellules sénescentes, qui permet la détection histochimique d’activité β-galactosidase lysosomale à suboptimum pH (6 ou 5.5). En comparaison avec d’autres tests, comme la cytométrie en flux, cela permet l’identification des cellules sénescentes dans leur environnement résident, qui offre des informations précieuses telles que l’emplacement ayant trait à l’architecture tissulaire, la morphologie et le possibilité de couplage avec les autres marqueurs par immunohistochimie (IHC). La limitation majeure de l’essai de SA-β-Gal est l’exigence des échantillons frais ou congelés.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour comprendre comment cellulaire sénescence favorise cellulaire plasticité et tissus regeneration in vivo. SA-β-Gal nous permet de détecter les cellules sénescentes dans le muscle squelettique sur blessure, ce qui est un système bien établi pour étudier la régénération des tissus. De plus, nous utilisons IHC pour détecter Nanog, un marqueur des cellules souches pluripotentes, dans un modèle de souris transgénique. Ce protocole permet d’examiner et de quantifier la sénescence cellulaire dans le contexte de la plasticité cellulaire induite et in vivo de reprogrammation.

Introduction

Sénescence cellulaire est une forme de réponse au stress que se caractérise par un arrêt du cycle cellulaire stable. Au cours de la dernière décennie, les recherches ont fermement établi que la sénescence est associée liée divers processus biologiques et pathologiques, y compris le développement embryonnaire, la fibrose et organisme vieillissement^1,2. Sénescence cellulaire a été identifiée dans les fibroblastes humains à la fin de leur durée de vie réplicative déclenchée par les télomères de raccourcir de³. Outre le stress réplicatif, il y a beaucoup d’autres stimuli qui peut induire la....

Protocole

animaux ont été traités selon les directives de la Communauté européenne et le Comité d’éthique des protocoles de l’Institut Pasteur (CETEA) approuvé.

1. préparation des Solutions Stock

1. préparer les documents pour fixation d’échantillon de muscle. Dissoudre 0,5 g de gomme adragante avec 20 mL d’eau à la droite pour rendre le milieu de congélation-enrobage pour la fixation des muscles.
2. Préparer les solutions pour la coloration de SA-β-Gal.
   1. Préparer les solutions mères de K ₃ Fe(CN) ₆ (100 mM), K ₄ Fe(CN) ₆ (100 mM), MgCl ₂ (1 M) en dissolva....

Résultats

Détection de la sénescence cellulaire induite par des blessures musculaires

Il a été démontré récemment que blessure musculaire induit la sénescence cellulaire transitoire¹⁴. À 10 jours après la lésion (DPI), la majorité des myofibres endommagés est en cours de régénération avec noyaux situés au centre, une caractéristique de la régénération des fibres musculaires, et l’architecture du muscle est rétablie. L.......

Discussion

Ici, nous présentons une méthode pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique de souris reprogrammables. Cette méthode pourrait être utilisée pour évaluer et quantifier les deux sénescence et induire une plasticité cellulaire in vivoet examiner le rôle de la sénescence dans la réparation des tissus et la régénération.

Dans le protocole actuel, le dosage de la sénescence associées aux β-galactosidase (SA-β-Gal) est utilisé pour .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
K3Fe(CN)6	Sigma	13746-66-2	Pour SA-&beta ; Solution de coloration Gal
K4Fe(CN)6	Sigma	14459-95-1	Pour SA-&beta ; Solution de coloration Gal
MgCl2	Sigma	7786-30-3	Pour SA-&beta ; Solution de coloration
Gal X-Gal	Sigma	B4252	Pour SA-&beta ; Solution de coloration Gal
Doxycycline	Sigma	D3447	Pour induire une reprogrammation in vivo
Cardiotoxine	Lotaxan Valence, France	L8102	Pour les lésions musculaires
Glutaraldéhyde	Sigma	111-30-8	Pour la solution de fixation
Paraformaldéhyde	Microscopie électronique science 50-980-487		Pour la solution
de fixationNaCitrate : Sodium Citrate monobasique bioxtra, anhydre	Sigma	18996-35-5	Pour solution de perméabilisation
Triton	Sigma	93443	Pour solution de perméabilisation
Sérum bovin	Albumine Sigma	A3608	Solution de lavage
Anticorps anti-Nanog	Signalisation cellulaire	8822S	Anticorps monoclonal
de lapin EnVision+ Kits (HRP. Lapin. DAB+)	Dako	K4010	Pour la révélation Nanog
Eosin 1 %	Leica	380159EOF	Contre-coloration
rapide rouge	Vector Laboratories	H-3403	Contre-coloration
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount	Fisher scientific	9990402	Solution de montage
Durcissement rapide Milieu de montage pour la microscopie : Eukitt® ;	Sigma	25608-33-7	Solution de montage
Microscope à contraste de phase Fond clair CKX41 : objectifs 10X-20X-40X	Microscope Olympus	CKX41	pour la quantification nanog
Souris : i4F-A	Abad et al., 2013	N/A	Modèle de souris reprogrammable
Muscle squelettique, tibial
	Zeiss	Axio Scan Z1	numérisation de diapositives

Scanner de lames antérieures