Évaluation des lésions induites par la sénescence et In Vivo reprogrammation dans le Muscle squelettique
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique sur blessure tout en induisant en vivo reprogrammation. Cette méthode convient pour évaluer le rôle de la sénescence cellulaire au cours de la régénération tissulaire et reprogrammation in vivo.
Abstract
Sénescence cellulaire est une réaction de stress qui se caractérise par un arrêt de la croissance cellulaire stable, ce qui est important pour de nombreux processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer et le vieillissement. Récemment, la sénescence a également été impliquée dans la régénération et la réparation des tissus. Par conséquent, il est devenu plus en plus critique pour identifier les cellules sénescentes en vivo. Associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-Gal) dosage est le dosage plus largement utilisé pour détecter les cellules sénescentes en culture et in vivo. Cette analyse est basée sur le contenu lysosomal accru dans les cellules sénescentes, qui permet la détection histochimique d’activité β-galactosidase lysosomale à suboptimum pH (6 ou 5.5). En comparaison avec d’autres tests, comme la cytométrie en flux, cela permet l’identification des cellules sénescentes dans leur environnement résident, qui offre des informations précieuses telles que l’emplacement ayant trait à l’architecture tissulaire, la morphologie et le possibilité de couplage avec les autres marqueurs par immunohistochimie (IHC). La limitation majeure de l’essai de SA-β-Gal est l’exigence des échantillons frais ou congelés.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour comprendre comment cellulaire sénescence favorise cellulaire plasticité et tissus regeneration in vivo. SA-β-Gal nous permet de détecter les cellules sénescentes dans le muscle squelettique sur blessure, ce qui est un système bien établi pour étudier la régénération des tissus. De plus, nous utilisons IHC pour détecter Nanog, un marqueur des cellules souches pluripotentes, dans un modèle de souris transgénique. Ce protocole permet d’examiner et de quantifier la sénescence cellulaire dans le contexte de la plasticité cellulaire induite et in vivo de reprogrammation.
Introduction
Sénescence cellulaire est une forme de réponse au stress que se caractérise par un arrêt du cycle cellulaire stable. Au cours de la dernière décennie, les recherches ont fermement établi que la sénescence est associée liée divers processus biologiques et pathologiques, y compris le développement embryonnaire, la fibrose et organisme vieillissement1,2. Sénescence cellulaire a été identifiée dans les fibroblastes humains à la fin de leur durée de vie réplicative déclenchée par les télomères de raccourcir de3. Outre le stress réplicatif, il y a beaucoup d’autres stimuli qui peut induire la sénescence, y compris des dommages ADN, stress oxydatif, signaux oncogènes et altérations génomiques/épigénomique, n’importe lequel peut éventuellement activer la p53/p21 et/ou pRB pathways to établir et renforcer la croissance permanente arrestation1. Une des caractéristiques importantes des cellules sénescentes est qu’ils restent un métabolisme actifs et robuste expriment un phénotype sécrétoire associée à la sénescence (SASP) : sécrétion de cytokines inflammatoires, facteurs de croissance et la matrice extracellulaire 4de facteurs. Facteurs de la SASP ont été proposées pour jouer un rôle important dans la médiation et d’amplifier l’effet de la sénescence, à cause de leurs effets puissants sur l’attrait des cellules immunitaires et altérer les tissus locaux et systémiques des milieux1. Fait intéressant, la sénescence a été récemment proposée semble importante pour tissus réparation et régénération de5,6. En outre, les données provenant de plusieurs laboratoires, y compris la nôtre, a suggéré que sénescence induite sur les dommages de tissu pourrait améliorer la plasticité cellulaire, par l’intermédiaire de SASP, pour promouvoir la régénération7–9. Par conséquent, toutes les nouvelles données soulignent l’importance de l’étude in vivode la sénescence.
Dans la période (iPSC) les cellules souches pluripotentes induites, plasticité cellulaire est la capacité d’une cellule d’acquérir une nouvelle identité et d’adopter un autre sort lorsqu’il est exposé à différents stimuli tant en culture et in vivo10. On sait que reprogrammation complète peut être obtenue en vivo11,12, où l’expression de la la cassette contenant les quatre facteurs de Yamanaka : Oct4, Sox2, Klf4et c-Myc de (OSKM) peut être induite en vivo pour promouvoir la formation de tératomes dans plusieurs organes. Donc, un modèle de souris reprogrammable (i4F) peut être utilisé comme un puissant système pour identifier les régulateurs critiques et les voies qui sont importants pour la plasticité cellulaire11.
Un système adapté et sensible le in vivo est essentiel de comprendre comment cellulaire sénescence réglemente la plasticité cellulaire dans le contexte de la régénération tissulaire. Nous présentons ici un système robuste et un protocole détaillé pour évaluer le lien entre la sénescence et la plasticité cellulaire dans le contexte de la régénération tissulaire. La combinaison du cheval (CTX) induite par les lésions musculaires dans le groupe de muscle Tibialis Anterior (TA), un système bien établi pour étudier la régénération tissulaire et le modèle de souris i4F, permet la détection de la sénescence cellulaire et in vivo reprogrammation pendant la régénération du muscle.
Afin d’évaluer le lien entre la plasticité cellulaire et de la sénescence, i4F souris sont blessés avec CTX pour induire des lésions musculaires aiguës et traités avec la doxycycline (0,2 mg/mL) pendant 7 jours pour induire en vivo reprogrammation. Alors qu’un CTX a induit des lésions musculaires aigus et protocole de régénération a été récemment publié13, pour des raisons éthiques, cette procédure va être omise dans le protocole actuel. TA muscle échantillons seront recueillis à 10 jours post blessures13, lorsque le sommet des cellules sénescentes ont été observés auparavant14. Ici, ce protocole détaillé décrit toutes les étapes nécessaires pour évaluer le niveau de la sénescence (via SA-β-Gal) et la reprogrammation (via IHC tachant de Nanog).
Associés à la sénescence bêta-galactosidase (SA-β-Gal) dosage est le dosage plus couramment utilisé pour détecter des cellules sénescentes en culture et in vivo15. Par rapport aux autres épreuves, le SA-β-Gal permet l’identification des cellules sénescentes dans leur environnement natif avec l’architecture de tissus intacts, ce qui est particulièrement important pour l’étude de in vivo . En outre, il est possible de coupler le dosage de SA-β-Gal avec les autres marqueurs à l’aide de IHC. Cependant, le test SA-β-Gal exige des échantillons frais ou congelés, qui reste une limitation majeure. Lorsque les tissus frais ou congelés sont couramment disponibles, tels que les échantillons congelés de muscle TA, SA-β-Gal est évidemment le test plus adéquat pour détecter les cellules sénescentes. Nanog est le marqueur permettant de détecter les cellules reprogramed pour deux raisons : 1) c’est un marqueur essentiel de pluripotence ; 2) plus important encore, son expression n’est pas Poussée par la doxycycline (dox), donc il détecte la pluripotence induite plutôt que l’expression forcée de la cassette de Yamanaka.
Il est important de noter que les protocoles de coloration présentés dans cette étude peuvent être réalisées séparément pour simplifier la procédure de quantification, mais peuvent également être faits dans une méthode de coloration conjointement afin de visualiser les deux sénescentes et cellules souches pluripotentes sur la même section.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une méthode pour détecter toutes deux de sénescence des cellules souches pluripotentes dans le muscle squelettique de souris reprogrammables. Cette méthode pourrait être utilisée pour évaluer et quantifier les deux sénescence et induire une plasticité cellulaire in vivoet examiner le rôle de la sénescence dans la réparation des tissus et la régénération.
Dans le protocole actuel, le dosage de la sénescence associées aux β-galactosidase (SA-β-Ga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes redevables à Clemire Cimper pour son excellent support technique. Travail dans le laboratoire de H.L. a été financée par l’Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche scientifique et l’Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d’excellence Revive, Investissement d’avenir ; ANR-10-LABX-73), l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) et la Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. et A.C. sont financés par le doctorat et bourses de recherche postdoctorales du Consortium revivre.
Materials
| K3Fe(CN)6 | Sigma | 13746-66-2 | For SA-β Gal staining solution |
| K4Fe(CN)6 | Sigma | 14459-95-1 | For SA-β Gal staining solution |
| MgCl2 | Sigma | 7786-30-3 | For SA-β Gal staining solution |
| X-Gal | Sigma | B4252 | For SA-β Gal staining solution |
| Doxycycline | Sigma | D3447 | For inducing in vivo reprogramming |
| Cardiotoxin | Lotaxan Valence, France | L8102 | For muscle injury |
| Glutaraldehyde | Sigma | 111-30-8 | For Fixation solution |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy science | 50-980-487 | For Fixation solution |
| NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre | Sigma | 18996-35-5 | For permeabilization solution |
| Triton | Sigma | 93443 | For permeabilization solution |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3608 | Washing solution |
| Antibody anti- Nanog | Cell signalling | 8822S | Rabbit monoclonal antibody |
| EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) | Dako | K4010 | For Nanog revelation |
| Eosin 1% | Leica | 380159EOF | Counterstainning |
| Fast red | Vector Laboratories | H-3403 | Counterstainning |
| Thermo Scientific Shandon Immu-Mount | Fisher scientific | 9990402 | Mounting solution |
| Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® | Sigma | 25608-33-7 | Mounting solution |
| Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives | Olympus | CKX41 | Microscope for Nanog quantification |
| Mouse: i4F-A | Abad et al., 2013 | N/A | Reprogrammable mouse model |
| Skeletal muscle, Tibialis Anterior | |||
| Slide Scanner | Zeiss | Axio Scan Z1 | slides scanning |
References
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