Summary

Оснастки чип для кросс-reactivity-свободных и без корректировщик мультиплексированных Immunoassays сэндвич

Published: November 13, 2017
doi:

Summary

Мы демонстрируем технологии чипа оснастку для выполнения иммуноанализа кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных сэндвич, просто щелкая два слайда. Оснастки аппарат используется для надежной передачи реагентов от microarray дна microarray. Оснастки чип может использоваться для любых биохимических реакций, требующих colocalization различных реагентов без перекрестного загрязнения.

Abstract

Мультиплексированных белка анализ показал Улучшенный диагностической чувствительностью и точностью по сравнению с одной белки. Microarrays антитела позволяют тысячи микро масштабе иммуноанализа выполняется одновременно на одном чипе. Сэндвич пробирного формат улучшает пробирного специфичность обнаружения каждой мишени с двумя антител, но страдает от перекрестной реактивности между реагентов, тем самым ограничивая их возможности мультиплексирования. Colocalization microarray антитела (ACM) был разработан для обнаружения кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных белка, но требует дорогостоящих корректировщик на месте для изготовления microarray дна во время анализов. В этой работе мы демонстрируем оснастки технологии чипа, который передает реагент от microarray дна microarray, просто щелкая две фишки вместе, таким образом не корректировщик требуется во время инкубации образца и последующего применения обнаружения антител (мазки) после Хранение предварительно пятнистый слайды, отделения подготовки слайдов от выполнения анализа. Оба одноместные и двухместные передачи методы представлены для достижения точного выравнивания между двумя microarrays и описаны изготовление слайд для обоих методов. Результаты показывают, что < был достигнут 40 мкм выравнивание с двойной передачей, достигнув массива плотность 625 пятна/см2. 50-plexed иммуноанализа была проведена продемонстрировать удобство использования оснастки чип в мультиплексированном белка анализа. Пределы обнаружения 35 белков находятся в диапазоне пг/мл.

Introduction

Группа состоит из нескольких белки biomarkers может обеспечить более высокой чувствительностью и специфичностью чем один биомаркеров в диагностике сложных заболеваний, как рак1,2. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) был золотой стандарт технологии, используемые в клинических лабораториях, достижение предела обнаружения на низких пг/мл в плазме, но пределы одной цели в Пробирной3,4,5. Microarrays антитела были разработаны для размещения тысячи миниатюрных анализы проведены параллельно на один Микроскоп слайд6,,78. Однако мультиплексирования возможности этого метода ограничено реагент driven перекрестной реактивности, вытекающих из применения смеси мазками, и она становится более проблематичным с учетом увеличения числа целевых показателей9,10 , 11. пла и др. заявили, что результирующий уязвимость мультиплекс сэндвич пробирного весы как 4N(N-1), где N — это количество целей12.

Чтобы смягчить перекрестной реактивности в microarrays антитела, colocalization microarray антитела (ACM) был разработан в нашей лаборатории для мультиплекс сэндвич пробирного12. На подложке с корректировщик microarray дна запятнаны захвата антител (кабины). После блокировки образцы применяются на поверхности, а затем отдельные мазки были замечены на же пятна с комплексом кабины антигена. Все сценарии перекрестной реактивности между антитела и антигены могут быть уменьшены с ACM, и были достигнуты пределы обнаружения в ПГ/мл. Однако протокол assay требует подготовки и кровянистые выделения мазками в ходе экспериментов с использованием корректировщик на месте microarray с высокой точностью для выравнивания цели, которая является дорогостоящим и трудоемким, ограничивающие широкое применение этой технологии в другие лаборатории. Портативных ACM, с именем оснастки чип был разработан для кросс-reactivity-бесплатно и бесплатно корректировщик мультиплекс сэндвич иммуноанализа13,14,15. Кабины и мазками предварительно заметили на слайд пробирного и передача слайд соответственно в формате microarray и хранятся. В ходе анализа слайды извлекаются и microarray мазками коллективно передаются на пробирного слайд, просто сдвинув две фишки вместе. Оснастки аппарат используется для передачи надежной реагента. Нитроцеллюлоза покрытием слайды с емкостью привязки относительно большой антитела были использованы в качестве пробирного слайды для поглощения жидких капель и таким образом содействия передаче реагента, однако, слайды дороже, чем обычные стекла слайды и microarray сканеры совместимы с непрозрачными слайды необходимы для приобретения сигнала.

В этой работе мы демонстрируем протокол выполнения мультиплекс сэндвич иммуноанализа с чипом оснастки. Роман оснастки аппарат был разработан для более удобной и надежной передачи реагент от microarray дна microarray. Важно отметить, что здесь мы создали метод передачи реагентов на обычные стекла слайды с чипом оснастки. 1024 пятна были успешно переведены и выровнены на стекло слайд, значительно расширить использование этой технологии в большинстве лабораторий.

Protocol

1. Изготовление и хранение оснастки микросхемы один метод ( Рисунок 1a) пятно кабины растворы, содержащие 400 мкг/мл антител и 20% глицерина в фосфат амортизированное saline (PBS) на нитроцеллюлозную (или функционализированных стекла) пробирного слайд с струйных коррек?…

Representative Results

Пробирного процедура для одно- и двухместные методы передачи показан на рисунке 1. В одной передаче кабины запятнаны прямо на слайде пробирного и мазками передаются на пробирного слайд после использования в шаблоне зеркало кабины (рис. 1a</stron…

Discussion

В этой работе мы представили оснастки чип технологии, что делает кросс-reactivity-бесплатный мультиплекс иммуноанализа широко доступны для исследователей с основные экспериментальной установки. В отличие от существующих microarrays антитела, не microarray корректировщик необходим для конечных пол?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Роб Сладек за использование струйных корректировщик. Мы отмечаем окончательное поддержки от канадской институтов для медицинских исследований (КНИИЗ), естественные науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ), Канадский научно-исследовательский институт рака общества и Канадский фонд для инноваций (CFI). D.J. Спасибо поддержки от Канада исследований кафедры.

Materials

Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
check_url/56230?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

View Video