انجذاب شرائح لتحديدكم ساندويتش متعدد خالية إلى reactivity المشتركة وخالية من نصاب
Summary
علينا أن نظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة لأداء تحديدكم ساندويتش متعدد خالية إلى reactivity المشتركة ببساطة العض شريحتين. جهاز الأداة تستخدم لنقل المواد الكاشفة موثوق من ميكرواري إلى ميكرواري. يمكن استخدام شرائح إضافية لأي من التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تتطلب كولوكاليزيشن كواشف المختلفة دون التلوث عبر.
Abstract
وقد أظهرت تحليل البروتين متعدد متفوقة التشخيص حساسية ودقة مقارنة بالبروتينات وحيدة. جسم [ميكروارس] السماح للآلاف من الصغر تحديدكم تنفيذها في وقت واحد على شريحة واحدة. تنسيق المقايسة ساندويتش يحسن خصوصية الفحص عن طريق الكشف عن كل هدف مع اثنين من الأجسام المضادة، ولكن يعاني من ه بين الكواشف مما يحد من قدراتها المتنوعة. جسم كولوكاليزيشن ميكرواري (ACM) قد وضعت للكشف عن البروتين متعدد خالية إلى ريكتيفيتي المشتركة، ولكن يتطلب نصاب مكلفة في الموقع لتلفيق ميكرواري خلال فحوصات. في هذا العمل، ونظهر تكنولوجيا رقاقة المفاجئة التي تنقل الكاشف من ميكرواري إلى ميكرواري ببساطة أطباق رقائق اثنين معا، وبالتالي يلزم لا نصاب أثناء حضانة عينة والطلب اللاحق للكشف عن الأجسام المضادة (اللمسات) عند تخزين الشرائح السابقة رصدت، الناي بإعداد الشرائح من تنفيذ المقايسة. يتم عرض كلا أساليب نقل مفردة ومزدوجة تحقيق المواءمة الدقيقة بين [ميكروارس] اثنين وشرح لتصنيع الشرائح لكلا الأسلوبين. وتبين النتائج أن < قد تحقق 40 ميكرومتر المحاذاة مع نقل مزدوجة، والوصول بكثافة صفيف من 625 البقع/سم2. وأجريت المناعة 50-بليكسيد لإثبات إمكانية استخدام رقاقة المفاجئة في تحليل البروتين متعدد. حدود الكشف عن البروتينات 35 في نطاق بيكوغرام/مل.
Introduction
قد توفر فريق يتألف من البروتينات المتعددة المؤشرات الحيوية أعلى حساسية وخصوصية من العلامات البيولوجية واحدة في تشخيص الأمراض المعقدة مثل السرطان1،2. وقد مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (إليزا) معيار الذهب التكنولوجيا المستخدمة في المختبرات السريرية تحقيق حد كشف في انخفاض بيكوغرام/مل في البلازما، ولكن حدود لهدف واحد كل مقايسة3،،من45. وقد وضعت جسم [ميكروارس] لاستيعاب الآلاف من المنمنمة فحوصات أجريت بالتوازي على مجهر واحد شريحة6،،من78. ومع ذلك، محدودة القدرة المتنوعة لهذا الأسلوب التي يحركها كاشف ه، الناشئة عن تطبيق مزيج اللمسات، ويصبح أكثر إشكالية مع عدد متزايد من أهداف9،10 , 11-جيش التحرير الشعبي الصيني وآخرون. وقد ذكر أن ضعف الناتج مقايسة ساندويتش متعدد المقاييس ك 4N(N-1) حيث N هو عدد الأهداف12.
للتخفيف من ه في جسم [ميكروارس], جسم كولوكاليزيشن ميكرواري وضعت (ACM) في المختبر ل المقايسة ساندويتش متعدد12. التقاط الأجسام المضادة (سيارات الأجرة) رصدت على الركازة مع نصاب ميكرواري. بعد تطبيق عينات حظر على السطح، وثم رصدت اللمسات الفردية على البقع نفسها مع المجمع مستضد cAb. يمكن تخفيف جميع السيناريوهات ه بين الأضداد والمستضدات مع ACM، وحدود الكشف في pg/mL قد تحققت. ومع ذلك، يتطلب البروتوكول المقايسة إعداد واكتشاف اللمسات أثناء تجارب باستخدام نصاب ميكرواري في الموقع بدقة عالية لغرض المحاذاة، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتحد من التطبيق الواسع النطاق لهذه التكنولوجيا في مختبرات أخرى. ACM يده، يدعى رقاقة المفاجئة وضعت للمشتركة الحرة reactivity وخالية من نصاب متعدد ساندويتش تحديدكم13،،من1415. سيارات الأجرة واللمسات مسبقاً رصدت على شريحة مقايسة وشريحة نقل على التوالي في تنسيق ميكرواري وتخزينها. أثناء الفحص، يتم استرداد الشرائح ونقلت ميكرواري اللمسات جماعياً على شريحة المقايسة ببساطة العض رقائق اثنين معا. يستخدم جهاز المفاجئة لنقل كاشف موثوق بها. استخدمت الشرائح النيتروسليلوز المغلفة بقدرة ربط جسم كبيرة نسبيا كالشرائح المقايسة لامتصاص قطرات السائل ومما ييسر نقل الكاشف، بيد الشرائح أكثر تكلفة من الشرائح الزجاجية العادية وميكرواري الماسحات الضوئية المتوافقة مع الشرائح غير الشفافة ضرورية للحصول على إشارة.
في هذا العمل، ونظهر البروتوكول المنفذ المناعة ساندويتش متعدد مع شريحة إضافية. قد وضعت جهاز رواية مبكرة لنقل كاشف أكثر ملائمة وموثوق بها من ميكرواري إلى ميكرواري. الأهم من ذلك، أنشأنا هنا طريقة نقل الكاشف على الشرائح الزجاجية العادية مع رقاقة المفاجئة. البقع 1024 تم بنجاح نقل والانحياز إلى شريحة زجاج، إلى حد كبير توسيع نطاق استخدام هذه التكنولوجيا في معظم المختبرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل، وقد قدمنا عن تكنولوجيا رقاقة الأداة يجعل تحديدكم خالية إلى reactivity المشتركة المتعددة المتاحة على نطاق واسع للباحثين مع الإعداد التجريبية الأساسية. مختلفة من القائمة جسم [ميكروارس]، لا يوجد نصاب ميكرواري المسبق للمستخدمين النهائيين. أظهر كل واحد وضعف أساليب نقل، ونقل مزدوج يت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور روب سلاديك لاستخدام نصاب النافثة للحبر. ونعترف الدعم النهائي من “المعاهد الكندية” للبحوث الصحية (استوفوا)، والعلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة)، والمعهد الكندي للبحوث المجتمع السرطان ومؤسسة كندا للابتكار (CFI). دي جي بفضل دعم من “كرسي أبحاث كندا”.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
