Knipse Chip for Cross-reactivity-fri og Spotter-fri multiplex Sandwich immunanalyser
Summary
Vi viser en fest chip teknologi for å utføre cross-reactivity-fri multiplex sandwich immunanalyser ved å klikke bare to lysbilder. En snapin-apparater brukes for pålitelig overføring reagenser fra microarray til microarray. Fest chip kan brukes for alle biokjemiske reaksjoner som krever colocalization av forskjellige reagenser uten kryss-kontaminering.
Abstract
Multiplex protein analyser har vist bedre diagnostiske følsomhet og nøyaktighet i forhold til enkelt proteiner. Antistoff microarrays tillate tusenvis av mikro-skala immunanalyser utføres samtidig på én enkelt brikke. Sandwich analysen formatet forbedrer analysen spesifisitet av oppdager hvert mål med to antistoffer, men lider av kryssreaktivitet mellom reagenser dermed begrenser deres multipleksing evner. Antistoff colocalization microarray (ACM) er utviklet for cross-reactivity-fri multiplex proteinet oppdagelsen, men krever en dyre spotter stedets microarray fabrikasjon under analyser. I dette arbeidet viser vi en fest chip teknologi som overfører reagens fra microarray til microarray av bare knipser cents sammen, dermed ingen spotter kreves under inkubasjon og anvendelse av gjenkjenning antistoffer (dAbs) på lagring av pre flekkete lysbilder, dissociating lysbilde utarbeidelse fra analysen kjøring. Både enkle og doble overføring presenteres for å oppnå nøyaktig justering mellom de to microarrays og lysbildet fabrikasjon for begge metodene beskrives. Resultatene viser at < 40 μm justering er oppnådd med dobbel overføring, nå en rekke tetthet 625 flekker/cm2. En 50-plexed immunanalyse er utført for å demonstrere brukbarheten av snapin chip multiplex protein analyse. Grensene for påvisning av 35 proteiner er i området av pg/mL.
Introduction
Et panel av biomarkers bestående av flere proteiner kan gi høyere sensitivitet og spesifisitet enn en enkelt biomarkør i diagnostikk av komplekse sykdommer som kreft1,2. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) har vært gullstandarden teknologien som brukes i kliniske laboratorier oppnå en grense på gjenkjenning på lav pg/mL i plasma, men grensene til ett mål per analysen3,4,5. Antistoff microarrays er utviklet for imøtekommende tusenvis av miniatyriserte analyser gjennomført parallelt på en enkelt mikroskop lysbilde6,7,8. Men multipleksing evnen til denne metoden er begrenset av reagens-drevet kryssreaktivitet, som oppstår ved bruk av en blanding av dAbs, og det blir mer problematisk med et økende antall mål9,10 , 11. Pla et al. har uttalt at det resulterende sikkerhetsproblemet av en multiplex sandwich analysen skalaer som 4N(N-1) der N er antallet mål12.
For å redusere kryssreaktivitet i antistoff microarrays, antistoff colocalization microarray er (ACM) utviklet i vårt laboratorium for multiplex sandwich analysen12. Fange antistoffer (drosjer) er oppdaget på et substrat med et microarray spotter. Etter blokkering prøver brukes på overflaten, og deretter individuelle dAbs er oppdaget på de samme stedene med cAb-antigen komplekset. Alle kryssreaktivitet scenarier mellom antistoffer og antigener kan reduseres med ACM og grensene for gjenkjenning på pg/mL er oppnådd. Analysen protokollen krever imidlertid forbereder og dAbs spotting eksperimenter bruker en på stedet microarray spotter med høy presisjon for justering formål, som er dyrt og tidkrevende, begrense bred anvendelse av denne teknologien i andre laboratorier. En håndholdt ACM, kalt snapin chip har blitt utviklet for cross-reactivity-fri og spotter-fri multiplex sandwich immunanalyser13,14,15. Drosjer er dAbs pre oppdaget på et analysen lysbilde og en overføring lysbildet henholdsvis i microarray format og lagret. Under analysen, lysbildene er hentet og et microarray av dAbs overføres samlet inn i analysen lysbildet ved å bare klikke to brikkene sammen. En snapin-apparater brukes for pålitelig reagens overføring. Nitrocellulose belagt lysbilder med en relativt stor antistoff bindende kapasitet har blitt brukt som analysen lysbildene til å absorbere de flytende dråpene og dermed tilrettelegge reagens overføring, men lysbildene er dyrere enn vanlig glass lysbilder og microarray skannere kompatibel med ikke-gjennomsiktige lysbilder er nødvendig for signalet vinningen.
I dette arbeidet viser vi protokollen for å utføre en multiplex sandwich immunanalyse med en snap-chip. En ny snapin-apparater er utviklet for mer praktisk og pålitelig reagens overføring fra microarray til microarray. Viktigere, har her vi etablert reagens overføringsmetoden på vanlige glass lysbilder med snapin-chip. 1024 flekker var vellykket overført og justert på et glass lysbilde, betydelig utvide bruken av denne teknologien i de fleste laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet har vi presentert en fest chip teknologi som gjør cross-reactivity-fri multiplex immunanalyser tilgjengelig for forskere med eksperimentelle grunnoppsett. Forskjellig fra eksisterende antistoff microarrays, ingen microarray spotter kreves for sluttbrukere. Både enkle og doble overføring metoder er vist, og dobbel overføring gir overlegen justering nøyaktighet ned til ~ 40 μm til 98% flekker, med største misalignment 63 µm14. En ny snapin-apparater ble utviklet for å enkel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Rob Sladek for bruk av inkjet spotter. Vi erkjenner den siste støtten fra den kanadiske institutter for helse forskning (CIHR), Natural Science og Engineering Research Council for Canada (NSERC), den kanadiske kreft samfunnet Research Institute og Canada grunnlaget for innovasjon (CFI). DJ Takk støtte fra en Canada forskning stol.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
