Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays
Summary
Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.
Abstract
Multiplex Protein-Analyse ergab höhere diagnostische Sensitivität und Genauigkeit im Vergleich zu einzelnen Proteine. AntikörperMicroarrays erlauben Tausende Mikromaßstab Immunoassays gleichzeitig auf einem einzigen Chip durchgeführt. Sandwich-Assay-Format Spezifität des Assays erkennt jedes Ziel mit zwei Antikörper verbessert, sondern Kreuzreaktivität zwischen Reagenzien, wodurch ihre multiplexing Fähigkeiten leidet. Antikörper NS1 Microarray (ACM) für cross-reactivity-freie gemultiplexten Proteindetektion entwickelt wurde, aber erfordert eine teure vor-Ort-Spotter für Microarray Herstellung während der Tests. In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen eine Snap-Chip-Technologie, die Reagenz von Microarray-Microarray überträgt, indem einfach schnappen zwei Chips zusammen, somit kein Spotter während der Inkubation der Probe und Nachanmeldung Erkennung Antikörper (Tupfer) auf benötigt wird Lagerung von Pre-gefleckte Folien, Wehre die Folie Vorbereitung von Assay Ausführung. Sowohl Einzel- und Doppelzimmer Transfermethoden werden vorgestellt, um genaue Ausrichtung zwischen den beiden Microarrays zu erreichen und die Herstellung der Folie für beide Methoden werden beschrieben. Ergebnisse zeigen, dass < mit doppelten Transfer erreichen eine Array-Dichte von 625 Punkte/cm240 μm Ausrichtung erreicht wurde. Ein 50-Plexed-Immunoassay wurde durchgeführt, um die Nutzbarkeit des Snap-Chips in Multiplex Protein-Analyse zu demonstrieren. Nachweisgrenzen von 35 Proteine befinden sich in der Reichweite des Pg/mL.
Introduction
Eine Jury bestehend aus mehreren Proteinen Biomarker können höhere Sensitivität und Spezifität als einen einzigen Biomarker in der Diagnostik von komplexen Krankheiten wie Krebs1,2. Die Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) wurde der Goldstandard Technik in klinischen Labors erreichen maximal Erkennung bei niedrigen Pg/mL im Plasma, aber Grenzen auf ein Ziel pro Assay3,4,5. AntikörperMicroarrays sind entwickelt worden, denn Platz für Tausende von miniaturisierten Assays parallel auf einem einzigen Mikroskop Folie6,7,8durchgeführt. Jedoch die multiplexing Fähigkeit dieser Methode wird durch Reagenz-driven Kreuzreaktivität, die aus der Anwendung eines Gemisches aus Spitzen, begrenzt und wird es schwieriger mit einer wachsenden Zahl von Zielen9,10 , 11. Pla Et Al. haben erklärt, dass die resultierende Anfälligkeit eines Multiplex-Sandwich-Assays als 4N(N-1) Schuppen wo N ist die Anzahl der Ziele12.
Um Kreuzreaktivität in AntikörperMicroarrays, Antikörper NS1 Microarray zu mildern wurde in unserem Labor für Multiplex-Sandwich Assay12(ACM) entwickelt. Capture-Antikörper (Kabinen) sind auf einem Substrat mit einem Microarray-Spotter gesichtet. Nach Sperre Proben sind auf der Oberfläche aufgetragen, und dann einzelne Pinselstriche werden an den gleichen Stellen mit dem cAb-Antigen-Komplex gesichtet. Alle Szenarien der Kreuzreaktivität zwischen Antikörpern und Antigenen mit ACM abgeschwächt werden können, und Nachweisgrenzen bei Pg/mL erreicht wurden. Allerdings erfordert der Assay-Protokoll vorbereiten und Schmierblutungen die Pinselstriche während der Experimente mit einer vor-Ort-Microarray-Spotter mit hoher Präzision zwecks Ausrichtung, die teuer und zeitaufwendig ist, begrenzt die breite Anwendung dieser Technologie in anderen Labors. Ein handheld ACM, benannt Snap-Chip wurde entwickelt für cross-reactivity-frei und Spotter-freie multiplex-Sandwich Immunoassays13,14,15. Kabinen und tupft sind bereits gesichtet auf ein Assay und ein Transfer-Folie bzw. im Microarray-Format gespeichert. Während der Test die Folien abgerufen werden und ein Microarray tupft sind gemeinsam auf der Assay-Folie durch einfach fangen die beiden Chips zusammen übertragen. Ein Snap-Apparat ist für zuverlässige Reagenz Übertragung verwendet. Nitrozellulose, beschichtete Folien mit einer relativ hohen Antikörper-Bindungskapazität als der Assay-Folien verwendet wurden, um die Flüssigkeitströpfchen absorbieren und somit Reagenz Transfer erleichtert, die Folien sind jedoch teurer als normales Glas Folien und microarray Scannern kompatibel mit nicht-transparenten Folien sind für die Signalerfassung notwendig.
In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen das Protokoll für die Durchführung einer Multiplex-Sandwich-Immunoassay mit einem Snap-Chip. Für bequeme und sichere Reagenz Übertragung von Microarray-Microarray wurde eine neuartige Snap-Apparat entwickelt. Wichtig ist, haben wir hier die Übertragungsmethode Reagenz auf regelmäßiges Glas-Objektträger mit dem Snap-Chip etabliert. 1024 Punkte wurden erfolgreich übertragen und auf einen Objektträger, erheblich erweitern den Einsatz dieser Technologie in den meisten Labors ausgerichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit haben wir eine Snap-Chip-Technologie vorgestellt, die cross-reactivity-freie Multiplex-Immunoassays für die Forscher mit einfachen Versuchsaufbau weithin verfügbar macht. Anders als bei bestehenden AntikörperMicroarrays, benötigt keine Microarray-Spotter für Endnutzer. Sowohl Einzel-als auch Doppelzimmer Transfermethoden demonstriert, und doppelte Übertragung bietet überlegene Ausrichtung Genauigkeit bis zu ~ 40 μm bei 98 % Flecken, mit die größten Fehlausrichtung von 63 µm14…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Rob Sladek für die Verwendung von Inkjet-Spotter. Wir anerkennen die letzte Unterstützung der kanadischen Institute für Gesundheit Forschung (CIHR), die Naturwissenschaft und Engineering Research Council of Canada (NSERC), die kanadische Krebs Gesellschaft Research Institute und Canada Foundation für Innovation (CFI). D.J. Dank Unterstützung von einem Canada Research Chair.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
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