تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

Summary

ويصف هذا البروتوكول وضع استراتيجية عامة لتجديد التجارية ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية خالية من التسمية تهدف إلى إنقاذ على فحوصات أوفميكروتشيب-على أساس تكاليف تشغيل عالية. وتشمل عملية التجديد الهضم التربسين، الشطف مع الإيثانول والمياه، وخطوة لغزل، الذي يتيح للاستخدام المتكرر للرقائق.

Abstract

تحليل يستند إلى الخلية خالية من التسمية مفيد لدراسة الكيمياء الحيوية نظراً لأنها لا تتطلب استخدام الحيوانات التجريبية. نظراً لقدرته على توفير معلومات أكثر دينامية حول الخلايا تحت ظروف فسيولوجية من فحوصات الكيمياء الحيوية الكلاسيكية، هذا الإنزيم الخلية خالية من التسمية في الوقت الحقيقي على أساس مبدأ مقاومة كهربائية هو جذب المزيد من الاهتمام في الماضي العقد. ومع ذلك، قد يكون استخدامها العملي محدودة بسبب تكلفة باهظة الثمن نسبيا للقياس، والتي تستخدم لمحلل الخلية مكلفة الرقائق الذهب المتاح للاستهلاك. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير استراتيجية عامة لتجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية خالية من العلامة تجارية. وتشمل عملية التجديد الهضم التربسين، الشطف مع الإيثانول والمياه، وخطوة لغزل. الطريقة المقترحة قد تم اختبارها وأظهرت أن تكون فعالة للتجدد والاستخدام المتكرر للوحات الإلكترونية التجارية ثلاث مرات على الأقل، التي ستساعد الباحثين حفظ على التكلفة العالية لفحوصات الخلية في الوقت الحقيقي.

Introduction

نظراً لأن كفاءة وأقل عملية تجريبية ذات العمالة الكثيفة، خالية من تسمية الخلية المستندة إلى التكنولوجيا شهدت نمواً سريعاً على مدى العقد الماضي لأغراض تحليلية، فضلا عن الفحص كما هو الحال في الجانب المتعلق بالبروتينات^1،2 ، المخدرات تسليم³، إلخ^4،5 مقارنة مع أساليب الكيمياء الحيوية التقليدية تهدف إلى تحليل الخلية، فحص الخلية خالية من التسمية في الوقت الحقيقي مع النموذج الأولى وضعتها جيفيير وزملاء العمل السابق⁶ يرتكز على مبدأ تسجيل التغييرات إشارة كهربائية على سطح الرقائق الدقيقة المرفقة بالخلية، التي تسمح بقياس مستمر لنمو الخلايا أو الهجرة بطريقة كمية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، أطلق خلية في الوقت الحقيقي إلكترونية الاستشعار عن نظام (RT-مؤتمر الإحصائيين الأوروبيين) باستخدام مبدأ الكشف على أساس مقاومة كهربائية تم إدخال^7،8 وهو محلل تجاري خلية في الوقت الحقيقي (RTCA) في الآونة الأخيرة لمختبر البحوث⁹.

محلل الخلية في الوقت الحقيقي التجاري أساسا يقرأ إشارات مقولة الخلايا لمقاومة الكهربائية، التي تنتج عن التغيرات الفسيولوجية للخلايا المحتضنة بما في ذلك انتشار الخلايا، والهجرة والبقاء، ومورفولوجيا والتقيد سطح الرقائق الدقيقة^10،11. كذلك يتم تحويل هذه الإشارات الكهربائية بالمحلل إلى معلمة هو اسم فهرس الخلية (CI) لتقييم حالة الخلية. تغيير المقاومة من الرقائق الدقيقة أساسا يعكس البيئة الأيونية المحلية الخلايا المغطاة في واجهة القطب/الحل. ولذلك، الأداء التحليلي لمحلل الخلية تعتمد اعتماداً كبيرا على وحدة الاستشعار الأساسية، المتاح من الرقائق الدقيقة (أي، ما يسمى لوحات إلكترونية، مثلاً، 96/16/8-جيدا)، التي تصنع من صفت ميكروليكتروديس الذهب طباعة ليثوجرافيكالي في الجزء السفلي من الآبار الحضانة. ميكروليكتروديس الذهب التجمع في شكل خط في الدائرة (الشكل 1)، وتغطي معظم مساحة السطح من الآبار الحضانة، التي تسمح بالكشف عن الخلايا المرفقة^{3،12،13 حيوية وحساسة ،14}. كاريتاس الدولية سوف تزيد في حالة المزيد من التغطية السطحية للخلايا على الرقاقة، وينخفض عندما تتعرض الخلايا لأنها سامة أسفر عن المبرمج. على الرغم من أن محلل الخلية في الوقت الحقيقي قد استخدمت غالباً لتحديد سيتوتوكسيسيتي¹¹ والسمية العصبية¹⁵ وتوفير معلومات الحركية أكثر من أسلوب النهاية الكلاسيكية، لوحات إلكترونية يمكن التخلص منها هي تكلفة الاستهلاكية.

وحتى الآن، كانت هناك لا الأساليب المتاحة لتجديد اللوحة الإلكترونية، التي ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن شروط تجديد قاسية، مثل حمض الخليك أو حل البيرانا هي¹⁷تشارك^{16،، 18}، وقد تغير الوضع الكهربائية للرقائق الذهبية. ولذلك، سوف يكون أسلوب معتدل وتتسم بالكفاءة لإزالة الخلايا ملتصقة وغيرها من المواد من سطح رقائق الذهب مرغوب فيه لعملية تجديد اللوحة الإلكترونية. وقد وضعنا مؤخرا بروتوكول يهدف إلى تجديد لوحات الإلكترونية المتاح باستخدام كواشف غير قابلة للتآكل ورقائق المجددة اتسمت الطرق الكهروكيميائية فضلا عن البصري¹⁹. باستخدام الكواشف المختبرية متوفرة بسهولة ومعتدلة بما في ذلك التربسين والايثانول، وقد أنشأنا طريقة عامة لتجديد اللوحة الإلكترونية التجارية دون الآثار السلبية، التي يتم تطبيقها بنجاح على تجديد هما النوعان الرئيسيان لوحة إلكترونية (16 و L8) المستخدمة ل RTCA.

Protocol

ملاحظة: بشكل عام، عملية التجديد يشمل الهضم التربسين والشطف خطوة مع الإيثانول والمياه. وقت الهضم تتغير وفقا لعدد الخلايا المستخدمة ونوع وعدد من الخلايا المستخدمة قد تختلف تبعاً لأغراض تجريبية. وينصح للتحقق من الرقائق المجددة استخدام أساليب البصرية والكهروكيميائيه لتحسين شروط التجديد. أث…

Representative Results

خصائص السطح من الرقائق الذهبية: تجديد الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول كانت المبين في الشكل 1. ويبين الشكل 2 مجهرية سطح صور جديد وإعادة إنشاء لوحات إلكترونية بالمجهر الضوئي. كما هو مبين في الشكل 2 ألف</strong…

Discussion

يمكننا تلخيص عدة الأساليب المتاحة^17،،من^2324،25،26 لتجديد الرقائق في الجدول 1. وتشارك هذه الأساليب أساسا، نسبيا قسوة الظروف التجريبية لتحقيق التجديد الكامل للرقائق بسبب وجود تفاعلات جزيء جزيء ق…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.