Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

Summary

Este protocolo descreve uma estratégia geral para regenerar microeletrodos de ouro matriz comerciais equipados para um analisador de célula livre de rótulo visto economia sobre as alta execução custos ofmicrochip ensaios baseados. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, enxaguando com água, etanol e uma etapa de fiação, que permite o uso repetido de microchips.

Abstract

O ensaio de baseada em célula livre de rótulo é vantajoso para estudos bioquímicos por causa disso não requer o uso de animais experimentais. Devido à sua capacidade para fornecer informações mais dinâmicas sobre células sob condições fisiológicas do que ensaios bioquímicos clássicos, este ensaio de célula livre de rótulo em tempo real com base no princípio da impedância elétrica está atraindo mais atenção durante o passado década. No entanto, sua utilização prática pode ser limitada devido ao custo relativamente caro de medição, no qual caro consumível descartável ouro “microchips” é utilizados para o analisador de célula. Neste protocolo, temos desenvolvido uma estratégia geral para regenerar a matriz microeletrodos ouro equipados para um analisador de célula livre de etiqueta comercial. O processo de regeneração inclui digestão do trypsin, lavagem com etanol e água e uma etapa de fiação. O método proposto foi testado e demonstrou ser eficaz para a regeneração e o uso repetido de placas eletrônicas comerciais pelo menos três vezes, que ajudará pesquisadores salvar sobre o alto custo de execução dos ensaios de celular em tempo real.

Introduction

Devido ao seu eficiente e menos trabalhoso processo experimental, tecnologia livre de etiqueta baseada em célula tem testemunhado o rápido crescimento na última década para fins analíticos, bem como seleção, tais como no aspecto da proteômica^1,2 , drogas entrega³, etc.^4,5 comparado com métodos bioquímicos tradicionais destinadas a análise de células, ensaio de pilha rótulo livre em tempo real com o protótipo desenvolvido pela Giaever e colegas de trabalho anteriormente⁶ é baseado no princípio de gravar alterações de sinal elétrico na superfície da célula-anexado microchips, que permitem uma medição contínua de crescimento celular ou migração de forma quantitativa. Seguindo esta estratégia, foi lançado um celular em tempo real eletrônico de sensoriamento sistema (RT-CES) usando o princípio de detecção baseada em impedância elétrica foi introduzido^7,8 e, mais recentemente, um analisador de comercial celular em tempo real (RTCA) para o laboratório de pesquisa⁹.

O analisador de celular em tempo real comercial principalmente lê sinais evocados das células de impedância elétrica, que resultam as alterações fisiológicas das células incubadas incluindo proliferação celular, migração, morfologia, viabilidade e aderência sobre a superfície de “microchips”^10,11. Esses sinais elétricos são convertidos mais pelo analyzer em um parâmetro adimensional denominado índice célula (CI) para avaliar o estado da célula. A mudança da impedância de microchips reflete principalmente o ambiente local iônico das células cobertos na interface eletrodo/solução. Portanto, o desempenho analítico do analisador célula depende muito a unidade de sensoriamento de núcleo, os microchips descartáveis (i.e., chamadas placas eletrônicas, por exemplo, 96/16/8 poços), que são feitos de microeletrodos matriz de ouro Litograficamente, impresso no fundo dos poços de incubação. Os ouro microeletrodos montam em um formato de círculo-on-line (Figura 1) e cobrem a maior parte da superfície dos poços de incubação, que permitem a detecção dinâmica e sensível de células anexado^{3,12,13 ,14}. O CI aumentará no caso mais cobertura de superfície de células no chip e diminuir quando as células estão expostas a uma toxicidade resultando em apoptose. Embora o analisador em tempo real da célula tenha sido usado com frequência para determinar a citotoxicidade¹¹ e neurotoxicidade¹⁵ e fornecer mais informações cinéticas do método clássico de pontos de extremidade, as placas eletrônicas descartáveis são as mais caras consumíveis.

Até agora, não houve nenhum método disponível para a regeneração da placa eletrônica, que é provavelmente devido ao fato de que as condições de regeneração dura, tais como solução de piranha ou ácido acético são envolvidos^{16,17, 18}, que podem alterar o elétrico de microchips de ouro. Portanto, um método eficiente e suave para remover as células aderentes e outras substâncias da superfície dos chips de ouro será desejável para o processo de regeneração da placa eletrônica. Recentemente desenvolvemos um protocolo que visa a regeneração de descartáveis placas eletrônicas utilizando reagentes não-corrosivo e os chips regenerados foram caracterizados por métodos eletroquímicos, bem como óptico¹⁹. Ao utilizar reagentes de laboratório prontamente disponível e moderado, incluindo tripsina e etanol, temos estabelecido um método geral para regenerar a placa eletrônica comercial sem efeitos adversos, que é aplicada com sucesso para os dois tipos principais de regenerar da placa eletrônica (16 e L8) usaram para RTCA.

Protocol

Nota: em geral, o processo de regeneração inclui digestão de tripsina e a etapa de lavagem com água e etanol. O tempo de digestão muda de acordo com o número de células utilizadas e o tipo e o número de células utilizadas podem variar dependendo os fins experimentais. É aconselhável verificar os microchips regenerados usando métodos ópticos e eletroquímicos para otimizar as condições de regeneração. Durante o experimento, solúveis e insolúveis químicos podem estar envolvidos, e aqui estes dois casos …

Representative Results

Propriedades de superfície de microchips de ouro: os procedimentos de regeneração utilizados neste protocolo foram descritos na Figura 1. A Figura 2 mostra o microscópico fotos do fresco de superfície e regenerado placas eletrônicas por microscópio óptico. Como mostrado na Figura 2A e Figura 2, microscópicos observações indi…

Discussion

Estamos resumidos diversos métodos disponíveis^{17,23,24,25,26} para regenerar microchips no quadro 1. Basicamente, esses métodos envolveram relativamente duras condições experimentais para alcançar a regeneração completa de chips por causa da presença de interações de molécula-molécula forte como a do complexo imune usado para chips…

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.