חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת
Summary
פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה כללית להתחדש מסחרי microelectrodes זהב ערוכים מצויד מנתח תא ללא תווית שמטרתה שמירה על גבוהה זורמים עלויות מבוססות ofmicrochip מבחני. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג, המאפשרת שימוש חוזר ונשנה של שבבים.
Abstract
וזמינותו ללא תווית מבוססת תא הוא יתרון עבור מחקר ביוכימי בגלל זה אינו דורש השימוש של חיות ניסוי. בשל יכולתה לספק מידע דינמיות יותר על התאים בתנאים פיזיולוגיים מאשר מבחני הביוכימי הקלאסית, זו assay תא ללא תווית בזמן אמת בהתבסס על העיקרון עכבה חשמלית מושך יותר תשומת לב במהלך האחרון עשור. עם זאת, ניצול מעשי שלה עלולה להיות מוגבלת בשל העלות יקרה יחסית המדידה, שבו יקר בשבבים זהב חד פעמיים מתכלים משמשים במנתח התא. ב פרוטוקול זה, פיתחנו אסטרטגיה כללית להתחדש ערוכים microelectrodes זהב מצויד מנתח תא מסחרי ללא תווית. תהליך התחדשות כולל עיכול טריפסין, שטיפה עם אתנול ומים צעד ספינינג. השיטה המוצעת שנבדק ונמצא הוכח להיות יעיל עבור התחדשות ו חוזרות השימוש המסחרי לוחות אלקטרוניים לפחות שלוש פעמים, וזה יעזור חוקרים לשמור על ריצה העלות הגבוהה של מבחני תא בזמן אמת.
Introduction
בשל שלה יעיל ופחות עתירי עבודה התהליך ניסיוני, ללא תווית תא טכנולוגיה מבוססת חוותה צמיחה מהירה בעשור האחרון למטרות אנליטית, כמו גם הקרנת כגון בהיבט של פרוטאומיקס1,2 , סמים משלוח3, ועוד4,5 Compared עם שיטות מסורתיות הביוכימי מכוונות ניתוח תא, התא ללא תווית בזמן אמת assay עם האבטיפוס שפותחה על ידי Giaever ועמיתיו בעבר6 מבוסס על העיקרון של הקלטה אות חשמלי שינויים על פני השטח של התא-attached מיקרוצ’יפ, המתירים מדידה רציפה של צמיחת תאים או ההעברה באופן כמותי. בעקבות אסטרטגיה זו, הושק תא בזמן אמת אלקטרונית חש (RT-CES) המערכת באמצעות עקרון זיהוי מבוסס עכבה חשמלית היה הציג7,8 ולאחרונה מנתח מסחרי תא בזמן אמת (rtca) מחקר מעבדה9.
במנתח תא בזמן אמת מסחרי בעיקר קורא אותות התאים עורר של עכבה חשמלית, אשר הם תוצאה של השינויים הפיזיולוגיים של תאי הדגירה כולל התפשטות תאים, הגירה, הכדאיות, מורפולוגיה, הדבקות על פני השטח של סחר חופשי10,11. אותות חשמליים כאלה מומרים עוד יותר על ידי מנתח פרמטר שהוא בשם תא אינדקס (CI) כדי להעריך את מצב תא. השינוי של עכבה של סחר חופשי משקף בעיקר הסביבה המקומית יונית בתאי מכוסה ב הממשק אלקטרודה/פתרון. לכן, ביצועי אנליטי במנתח תא מסתמכת במידה רבה על יחידת חישה הליבה, הפיוזים חד פעמיות (קרי, לוחות אלקטרוניים כביכול, למשל, 96/16/8-ובכן), אשר עשויים ערוכים microelectrodes זהב lithographically הדפיס בחלק התחתון של דגירה בארות. Microelectrodes זהב להרכיב בתבנית עיגול-ב-line (איור 1), מכסה את רוב פני השטח הבארות דגירה, המאפשרים זיהוי דינאמי ורגיש של תאים המצורפת3,12,13 ,14. המודיע להגדיל במקרה של כיסוי השטח יותר של תאים על השבב, או להקטין את כאשר תאים נחשפים toxicant וכתוצאה מכך אפופטוזיס. למרות במנתח תא בזמן אמת שימש לעתים קרובות כדי לקבוע cytotoxicity11 ו neurotoxicity15 ולספק מידע קינטי יותר מאשר השיטה הקלאסית נקודות קצה, הלוחות האלקטרוניים חד פעמיות הן מהבדים מתכלים.
עד עכשיו, היו אין שיטות זמינות לרגנרציה של צלחת אלקטרונית, שהוא כנראה בשל העובדה כי תנאים קשים התחדשות, כגון פיראניה פתרון או חומצה אצטית הם מעורבים16,17, 18, אשר עשוי לשנות המצב חשמלי של סחר חופשי זהב. לכן, שיטה קלה ויעילה להסרת התאים חסיד וחומרים אחרים מפני השטח של שבבי זהב יהיה רצוי עבור תהליך התחדשות צלחת אלקטרונית. לאחרונה פיתחנו פרוטוקול מכוון לרגנרציה של חד פעמיים צלחות אלקטרונית באמצעות מתכלה ריאגנטים, האסימונים regenerated התאפיינו שיטות אלקטרוכימיות, כמו גם אופטי19. באמצעות ריאגנטים המעבדה זמינות ולא מתון כולל טריפסין, אתנול, הקמנו שיטה כללית להתחדש לוח אלקטרוני מסחרי ללא תופעות לוואי, אשר מיושמת בהצלחה לחדש את שני סוגים עיקריים צלחת אלקטרונית (16 והן L8) משמש rtca ב.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו סיכם כמה משיטות17,23,24,25,26 ולשם רגנרציה בשבבים בטבלה1. בעיקרון, שיטות אלה מעורב בתנאים קשים יחסית ניסיוני כדי להשיג את התחדשות מוחלטת של שבבי עקב הנוכחות של מולקולה חזקה-מולקולה אינטראקצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (U1703118), פרויקט במימון עדיפות אקדמי תוכנית הפיתוח של ג’יאנגסו להשכלה גבוהה מוסדות (משטרת משמר החופים), ג’יאנגסו Shuangchuang התוכנית, קרנות פתוח של המפתח המדינה מעבדה כימותרפיה/Biosensing ו כימומטריה (2016015), את נבחרת מעבדה של ובמקרו-מולקולות ביולוגיות (2017kf05), פרופסור Jiangsu Specially-Appointed פרוייקט, סין.
Materials
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Stock reagents | reconstitution | Concentration used | Storage |
| Apo-transferrin | 10 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| N-acetyl cysteine | 5 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Sodium selenite | 2.5 mg/mL in H2O | 1:25,000 | -20°C |
| Collagen IV | 200 μg/mL in PBS | 1:100 | -80°C |
| TGF-b2 | 20 μg/mL in PBS | 1:10,000 | -20°C |
| IL-34 | 100 μg/mL in PBS | 1:1,000 | -80°C |
| Ovine wool cholesterol | 1.5 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparan sulfate | 1 mg/mL in H2O | 1:1,000 | -20°C |
| Oleic acid/Gondoic acid | Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol | 1:1,000 | -20°C |
| Heparin | 50 mg/mL in PBS | 1:100 | -20°C |
| Solutions | Recipe | Comments | |
| Perfusion Buffer | 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) | Use when ice-cold | |
| Douncing Buffer | 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ | Use when ice-cold | |
| Panning Buffer | 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite | Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. | |
| Collagen IV Coating | MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 | Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 | |
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid | Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
- Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
- Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
- Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
- Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
- Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
- Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
- Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
- Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
- Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
- Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
- Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
- Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
- Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
- Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
- Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
- Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
- Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
- Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
- Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
- McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
- Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
- Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).
