Régénération des microélectrodes or rangés, équipé d’un analyseur de cellule en temps réel

Summary

Ce protocole décrit une stratégie générale pour régénérer des microélectrodes or déployèrent commerciales équipés pour un analyseur de cellules libres étiquette visant à économiser sur les haute marche frais ofmicrochip analyses. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature, ce qui permet une utilisation répétée des micropuces.

Abstract

Le test de base de cellules exempt d’étiquette est avantageux pour étude biochimique à cause de cela ne nécessite pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. En raison de sa capacité à fournir des informations plus dynamiques sur les cellules dans des conditions physiologiques que les tests biochimiques classiques, cette analyse de cellules exempt d’étiquette en temps réel basée sur le principe de l’impédance électrique est d’attirer plus d’attention au cours des dernières décennie. Toutefois, son utilisation pratique peut être limitée en raison du coût relativement coûteux de la mesure, où coûteux consommables jetables or micropuces sont utilisés pour l’analyseur de la cellule. Dans ce protocole, nous avons développé une stratégie générale pour régénérer déployèrent microélectrodes or équipés d’un analyseur de commercial cellule exempte d’étiquette. Le processus de régénération comprend la digestion trypsique, lavage à l’éthanol et l’eau et une étape de filature. La méthode proposée a été testée et démontrée son efficacité pour la régénération et l’utilisation répétée des plaques électroniques commerciaux au moins trois fois, qui aidera les chercheurs enregistrer sur la cherté en cours d’exécution des essais sur des cellules en temps réel.

Introduction

Grâce à son efficace et moins fastidieux processus d’expérimentation, technologie exempte d’étiquette sur les cellules a connu une croissance rapide ces dix dernières années à des fins analytiques ainsi que la projection comme dans l’aspect de la protéomique^1,2 , livraison³, etc.^4,5 comparé avec des méthodes biochimiques traditionnelles visant à l’analyse cellulaire, analyse de cellules libres étiquette en temps réel avec le prototype développé par Giaever et collaborateurs précédemment^{6 de drogue} est basé sur le principe de l’enregistrement des modifications du signal électrique sur la surface de la cellule-attachée puces électroniques, qui permettent une mesure continue de la croissance cellulaire ou de migration de manière quantitative. Suite à cette stratégie, une cellule en temps réel (RT-CES) système utilisant le principe de détection impédance électrique était introduite^7,8 et, plus récemment, un analyseur commercial cellule en temps réel (RTCA) de détection électronique a été lancée laboratoire de recherche⁹.

L’analyseur de la cellule en temps réel commercial principalement lit les signaux évoqués LiPo de l’impédance électrique, entraînant des changements physiologiques des cellules couvés, y compris la prolifération cellulaire, migration, viabilité, la morphologie et l’adhérence sur le surface de micropuces^10,11. Ces signaux électriques est également convertis par l’analyseur dans un paramètre sans dimension nommé la cellule Index (CI) pour évaluer l’état de la cellule. Le changement de l’impédance des micropuces reflète principalement l’environnement ionique des cellules couvertes à l’interface électrode/solution. Par conséquent, les performances analytiques de l’analyseur de cellules s’appuie fortement sur l’unité de détection de base, les micropuces jetables(p. ex., ce qu’on appelle plaques électroniques, par exemple, 96/16/8 puits), qui sont faites de microélectrodes or rangés lithographically imprimé au bas du puits de l’incubation. Des microélectrodes or assemblent sous forme de cercle en ligne (Figure 1) et couvrent la majeure partie de la surface des puits d’incubation, qui permettent une détection dynamique et sensible de cellules attachées^{3,12,13 ,},¹⁴. Le CI augmentera dans le cas de couverture plus de la surface des cellules sur la puce et diminue lorsque les cellules sont exposées à un substance toxique, aboutissant à l’apoptose. Bien que l’analyseur en temps réel cellulaire a été fréquemment utilisé pour déterminer la cytotoxicité¹¹ et neurotoxicité¹⁵ et fournir plus d’informations cinétiques que la méthode classique de points de terminaison, les plaques électroniques jetables sont les plus coûteuses consommable.

Jusqu’à présent, il n’y a eu aucune méthodes disponibles pour la régénération de la plaque électronique, qui est probablement dû au fait que des conditions de régénération dure, comme solution de piranha ou acide acétique sont impliqués^{16,17, 18}, qui peuvent altérer l’État électrique de puces or. Par conséquent, une méthode douce et efficace pour enlever les cellules adhérentes et autres substances de la surface des puces or sera souhaitable pour le processus de régénération de la plaque électronique. Nous avons récemment mis au point un protocole visant à la régénération des plaques électroniques jetables, utilisant des réactifs non corrosifs et les puces régénérées sont caractérisés par des méthodes électrochimiques ainsi qu’optique¹⁹. En utilisant des réactifs de laboratoire facilement disponible et modérée comme la trypsine et éthanol, nous avons établi une méthode générale pour régénérer la plaquette commerciale électronique sans entraîner d’effets indésirables, qui est appliquée avec succès pour régénérer les deux principaux types de la plaque électronique (16 et L8) utilisé pour RTCA.

Protocol

Remarque : en général, le processus de régénération comprend la digestion trypsique et étape de rinçage à l’eau et l’éthanol. Le temps de digestion change selon le nombre de cellules utilisées et le type et le nombre de cellules utilisées peuvent différer selon les fins expérimentales. Il est conseillé de vérifier les micropuces régénérées à l’aide de méthodes optiques et électrochimiques afin d’optimiser les conditions de la régénération. Pendant l’expérience, produits chimiques solu…

Representative Results

Propriétés de surface des puces or: les procédures de régénération utilisées dans le présent protocole ont été décrits dans la Figure 1. La figure 2 montre le microscopique surface des images des produits frais et régénéré plaques électroniques par le microscope optique. Comme illustré à la Figure 2 a et 2 de la Figure</strong…

Discussion

Nous avons résumé plusieurs méthodes disponibles^{17,23,24,25,26} pour régénérer les micropuces dans le tableau 1. Fondamentalement, ces méthodes impliqués relativement rudes conditions expérimentales pour atteindre la régénération complète de puces à cause de la présence d’interactions molécules molécule forte telle que celle …

Materials

Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Stock reagents	reconstitution	Concentration used	Storage
Apo-transferrin	10 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
N-acetyl cysteine	5 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Sodium selenite	2.5 mg/mL in H2O	1:25,000	-20°C
Collagen IV	200 μg/mL in PBS	1:100	-80°C
TGF-b2	20 μg/mL in PBS	1:10,000	-20°C
IL-34	100 μg/mL in PBS	1:1,000	-80°C
Ovine wool cholesterol	1.5 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparan sulfate	1 mg/mL in H2O	1:1,000	-20°C
Oleic acid/Gondoic acid	Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol	1:1,000	-20°C
Heparin	50 mg/mL in PBS	1:100	-20°C
Solutions	Recipe		Comments
Perfusion Buffer	50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +)		Use when ice-cold
Douncing Buffer	200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++		Use when ice-cold
Panning Buffer	2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)	DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite		Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating	MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer	9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2		Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)	MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid		Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.