CRISPR/Cas9 複合体の前核注入による遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの生産
Summary
クラスター化の前核 (PN) 注射は定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) を空間、CRISPR 関連タンパク質 9 ヌクレアーゼ (CRISPR/Cas9) システムは非常に効率的な遺伝子組み換えゴールデン ハムスターの製造方法。ここで、遺伝子ノックアウト ハムスター CRISPR/Cas9 システムの生産のための詳細な PN 注入プロトコルについて述べる。
Abstract
前核 (PN) 注入法 1 セル段階の胚の前核に外国の遺伝物質を導入するマウスで設立。導入された遺伝物質が胚のゲノムに統合し、次の母親を促進する挿入された胚の転送外国の遺伝情報を持つトランスジェニック動物を生成します。マウスで成功、PN の注入は、他の多くの動物種で正常に適用されています。最近では、PN の注入は正常に遺伝子変更と試薬を紹介に雇われているいくつかの研究室でサイト固有の遺伝的改変を達成し、農場の動物種の CRISPR/Cas9 システムなどの活動。PN 注入による遺伝子改変動物を生産するマイクロインジェクション技術の特別なセットを習得しただけでなく研究者を理解しなければならない繁殖生理学と対象種の動作それぞれの種プレゼント ユニークなので課題。たとえば、シリアのハムスター胚がユニークな PN 注入技術では不可能だったこの種当社グループによる最近の進歩までその体外要件の処理します。私たち種変更 PN 注入プロトコルで、いくつかの遺伝子ノックアウト (KO) の生産でノック (KI) ハムスターは、人間の病気に正常に使用されている成功しました。ここでハムスター、胚の処理条件、胚転送プロシージャの受精卵に CRISPR/Cas9 複雑なを提供するため PN 注入手順を説明、遺伝子を生成するために必要な畜産変更ハムスター。
Introduction
黄金のシリアのハムスター (ん) は、生物医学研究のための最も広く使用されている齧歯動物のひとつです。米国農務省によると約 100,000 ハムスターが動物福祉法 (http://www.aphis.usda.gov; アクセスで覆われて種総研究所動物使用量の 13% を表す、2015 年にはアメリカ合衆国で使用されました。2017 年 3 月 10 日)。
ハムスターは、人間の病気の多数の研究では他の齧歯動物をいくつかの利点を提供しています。BOP 治療は主にラットおよび肺の甲状腺腫瘍、肝腫瘍を誘発するたとえば、ハムスターで誘導される N nitrosobis(2-oxopropyl) アミン (BOP) の病理膵膵管癌は人間の膵臓の腫瘍のようマウス1。ハムスターはアデノ ウィルスのレプリケーションをサポートする唯一の小さい齧歯動物であるため、またアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ベクトルおよび抗アデノ ウイルス薬2,3,4のテストに最適なモデルです。高脂血症の研究では、前記のハムスター モデルはマウスおよびラット上の優位性を提供しています別の例です。人間やハムスターが脂質代謝経路で偉大な類似を表わすし、両種コレステリル エステル転送タンパク (CETP)、脂質代謝、CETP が不在のマウスとラットの5において中心的な役割を担う遺伝子を運ぶ。また、ハムスターはエボラ ウイルス6への露出に続く人間の症状の代表的な出血性疾患を開発します。ハムスターは、また動脈硬化症7、口腔癌8、および炎症性 myopathies9の勉強に最適なモデルです。最近では、それがハムスターをアンデス ウイルスに高い感受性がアンデス ウイルス感染症10のみ齧歯動物モデルを提供するハンタ ウイルス肺症候群のような疾患を発症、実証もされています。
我々 は最近、ハムスターに CRISPR/Cas9 システムを適用することに成功しているし、遺伝子のいくつかの行を生産している信頼性の高い小さな齧歯動物モデルがない利用可能な人間の病気を研究する新しい遺伝的動物モデルの満たされていない必要性に対処するためハムスター11を設計されています。ハムスターの受精卵は、他の種で開発された PN の注入のプロトコルが適してなど環境調査に非常に敏感です。したがって、我々 はハムスター ハムスター胚体外を処理するための特別な要件に対応するため PN 注入プロトコルを開発しました。ここでは、CRISPR/Cas9 システムと受信者の女性に挿入された胚の転送を 1 つのガイド RNA (sgRNA) の準備から、付属の手順を使用して詳細な PN の注入手順をについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
良いひと疾患のモデルとしてシリアのハムスターの可能性を悪用する、我々 は、CRISPR/Cas9 複雑なハムスターのゲノムを対象とするを提供するため PN 注入プロトコルを開発しました。PN 注入プロトコルには、胚培養培地、温度、光13の波長などいくつかのキーの変数が最適化されます。また、ハムスターの遺伝子ターゲティングを正常に実施するために従う必要がありますい…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、国立研究所のアレルギーおよび感染症 (NIAID) の健康の国民の協会 (ZW) に受賞番号 1R41OD021979 の下で、次世代 BioGreen 21 からの研究助成金にサポートされていたプログラムは、韓国の許可なし。PJ01107704 (ZW) に no を与える。(IK) を PJ01107703。内容は著者の責任と BioGreen 21 の国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。博士ニコラス Robl は、原稿の編集を感謝いたします。
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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