Produktion von gentechnisch syrischen Goldhamster durch man Injektion des Komplexes CRISPR/Cas9
Summary
Man (PN) Injektion von den gruppierten dazwischen regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) und CRISPR-assoziierten Protein-9 Nuklease (CRISPR/Cas9) System ist ein hocheffizientes Verfahren zur Herstellung gentechnisch veränderter syrischen Goldhamster. Hier beschreiben wir die detaillierte PN Injektion Protokoll zur Herstellung von gen-Knockout-Hamster mit dem CRISPR/Cas9-System.
Abstract
Die man (PN) Injektionstechnik entstand zuerst bei Mäusen, fremden genetischen Materials in die Vorkerne von einzelligen Embryonen einzuführen. Die eingebrachte genetische Material kann das embryonale Genom integrieren und transgene Tiere zu erzeugen, mit fremden genetischen Information nach der Übertragung der injizierten Embryonen um Mütter zu fördern. Nach dem Erfolg bei Mäusen hat PN Injektion erfolgreich bei vielen anderen Tierarten angewendet. Vor kurzem, PN Injektion erfolgreich eingesetzte Reagenzien mit gen-modifizierende einzuführen Aktivitäten wie das CRISPR/Cas9 System, ortsspezifische Genveränderungen in mehreren Labors und Tierarten auf dem Bauernhof. Neben der Beherrschung der Sonderserie der Mikroinjektion Fähigkeiten genetisch veränderter Tiere per PN Injektion zu produzieren, müssen Forscher die Reproduktion Physiologie und das Verhalten der Zielarten, verstehen, weil jede Art einzigartig präsentiert Herausforderungen. Z. B. syrischen Goldhamster Embryonen haben einzigartige Anforderungen in-vitro- Handhabung, so dass PN Injektionstechniken bis neue Durchbrüche von unserer Fraktion nicht möglich in dieser Art waren. Mit unserer Spezies modifiziert PN Injektion Protokoll ist es uns gelungen in der Produktion mehrere gen Knockout (KO) und Profi (KI) Hamster, die zu Modell menschlicher Krankheiten erfolgreich eingesetzt werden. Hier beschreiben wir die PN-Injektion für die Zustellung der CRISPR/Cas9-Komplex an die Zygoten der Hamster, der Embryo Handhabung, Embryo-Transfer-Verfahren und Tierhaltung müssen genetisch geändert Hamster.
Introduction
Die syrischen Goldhamster (Mesocricetus Auratus) ist eines der am weitesten verbreitete Nagetiere für die biomedizinische Forschung. Nach dem US Department of Agriculture wurden ungefähr 100.000 Hamster in den Vereinigten Staaten im Jahr 2015, was 13 % der gesamten Labor tierische Nutzung unter dem Tierschutzgesetz (Http://www.aphis.usda.gov; zugegriffen fallenden Arten verwendet. 10. März 2017).
Der Hamster bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Nagetieren in der Studie eine Reihe von Krankheiten beim Menschen. Zum Beispiel die Histopathologie von N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) induzierte pankreatischen duktalen Adenokarzinome in Hamster ähnelt menschlichen Tumoren der Bauchspeicheldrüse, während BOP Behandlung vor allem Schilddrüse Tumoren bei Ratten und Lunge und Tumoren in der Leber induziert Mäuse-1. Da Hamster das nur kleine Nagetier gefunden, um die Replikation von Adenoviren unterstützen, sind sie auch das Modell der Wahl zu Testzwecken onkolytische Adenoviren-basierte Vektoren und Anti-Adenovirus Drogen2,3,4. Ein weiteres Beispiel, wobei das Hamster-Modell einen Vorteil gegenüber Mäusen und Ratten bietet, ist in der Studie von Hyperlipidämie. Menschen und Hamster weisen große Ähnlichkeiten in Lipid Stoffwechselwege und beide Arten tragen das Gen Kodierung Cholesteryl Ester-Transfer-Protein (CETP), das spielt eine zentrale Rolle in Lipid, Stoffwechsel, während CETP ist abwesend bei Mäusen und Ratten5. Darüber hinaus entwickeln Hamster repräsentativer für die menschliche Manifestation nach Exposition gegenüber Ebola-Virus6Hämorrhagische Krankheit. Hamster sind auch die Modelle der Wahl für Atherosklerose7, orale Karzinome8und entzündliche Myopathien9zu studieren. Vor kurzem wurde auch nachgewiesen, dass Hamster sehr anfällig für Virus-Infektion Anden sind und Hantavirus-Syndrom-ähnliche Lungenerkrankung, die nur Nagetier Modell der Anden Virus Infektion10zu entwickeln.
Bewältigung der ungedeckten Bedarf für neuartige genetische Tiermodellen, die Krankheiten des Menschen zu studieren, wo keine zuverlässige kleines Nagetier-Modell zur Verfügung steht, die wir vor kurzem gelungen, das CRISPR/Cas9 System anwenden, um den Hamster und haben mehrere Linien der gentechnisch hergestellt Hamster-11entwickelt. Hamster Zygoten reagieren empfindlich auf ökologischen Milieus, so dass die PN Injektion Protokolle entwickelt, bei anderen Spezies nicht geeignet sind. Daher entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Hamster, der die speziellen Anforderungen für den Umgang mit Hamster Embryonen in Vitrobeherbergt. Hier beschreiben wir die detaillierte PN-Injektion mit der CRISPR/Cas9-System und die dazugehörigen Schritte, von der Vorbereitung der einzelnen Führer RNA (SgRNA) zum Transfer von Embryonen injiziert in Empfänger Weibchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um das Potenzial der syrischen Goldhamster als Modelle für menschliche Krankheiten besser zu nutzen, entwickelten wir ein PN-Injektion-Protokoll für die Bereitstellung einer CRISPR/Cas9 Komplex um das Genom Hamster ausgerichtet. Das PN-Injektion-Protokoll optimiert mehrere entscheidende Variablen einschließlich der Embryo Kulturmedium, Temperatur und Wellenlängen von Licht13. Auch gibt es mehrere Hamster-spezifischen tierischen Umgang mit Verfahren, die für erfolgreiche Umsetzung gen gezielt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung, die in dieser Publikation berichtet wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) von den National Institutes of Health unter Nummer 1R41OD021979 Award (für ZW) und ein Forschungsstipendium von der nächsten Generation BioGreen 21 unterstützt. Programm, Republik Korea, gewähren keine. PJ01107704 (zu ZW) und Nein zu gewähren. PJ01107703 (zu IK). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder BioGreen 21. Wir danken Dr. Nikolas Robl für das Manuskript zu bearbeiten.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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