Producción de hámsters sirios dorados genéticamente por inyección Pronuclear del complejo CRISPR/Cas9
Summary
Inyección pronuclear de (PN) del cluster regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) y sistema CRISPR asociados 9 proteína nucleasa (CRISPR/Cas9) es un método altamente eficiente para la producción de transgénicos hámsters sirios dorados. Adjunto, describimos el protocolo detallado de la inyección del PN para la producción de hamsters de gene knockout con el sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
La técnica de inyección pronuclear (PN) fue establecida en ratones para introducir material genético extraño en los pronúcleos de embriones en estadío de una célula. El material genético introducido puede integrar en el genoma embrionario y generar animales transgénicos con información genética extranjera después de transferencia de los embriones inyectados para favorecer a las madres. Tras el éxito en ratones, inyección de PN se ha aplicado con éxito en muchas otras especies animales. Recientemente, inyección de PN se ha empleado con éxito para introducir reactivos gene-modificar actividades, tales como el sistema CRISPR/Cas9, para lograr modificaciones genéticas específicas en varios laboratorios y especies animales de la granja. Además de dominar el conjunto especial de microinyección habilidades para producir animales genéticamente modificados mediante la inyección de PN, los investigadores deben entender la fisiología de la reproducción y el comportamiento de las especies objetivo, debido a que cada especie presenta único desafíos. Por ejemplo, embriones de hámster sirio dorado tienen único manejo requisitos en vitro que técnicas de inyección de PN no fueron posibles en esta especie hasta descubrimientos recientes de nuestro grupo. Con nuestro protocolo de inyección de PN de especies modificadas, hemos tenido éxito en producir varios knockout del gen (KO) y knockin hámsteres (KI), que se han utilizado con éxito para enfermedades humanas modelo. Aquí describimos el procedimiento de inyección de PN para entregar el CRISPR/Cas9 complejo a los cigotos del hámster, condiciones de manejo de embriones, procedimientos de transferencia de embrión, y cría necesaria para producir genéticamente modificado hámsteres.
Introduction
El hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) es uno de los roedores más ampliamente utilizados para la investigación biomédica. Según el Departamento de agricultura de Estados Unidos, se utilizaron hámsters aproximadamente 100.000 en los Estados Unidos en 2015, representando el 13% de uso animal, laboratorio total entre las especies cubiertas por la ley de Bienestar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acceso 10 de marzo de 2017).
El hámster ofrece varias ventajas sobre otros roedores en el estudio de un número de enfermedades humanas. Por ejemplo, los adenocarcinomas ductal pancreático histopatología de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) inducida en hámster es similar a los tumores pancreáticos humanos, BOP tratamiento principalmente induce tumores de la glándula de tiroides en ratas y de pulmón y tumores del hígado en ratones1. Porque los hámsteres son lo solamente pequeño roedor encontrado para apoyar la replicación del adenovirus, son también el modelo de elección para las pruebas de vectores basados en adenovirus oncolíticos y drogas contra adenovirus2,3,4. Otro ejemplo en donde el modelo de hámster ofrece una ventaja sobre las ratas y ratones es en el estudio de la hiperlipidemia. Los seres humanos y hámsters presentan grandes semejanzas en vías metabólicas de lípidos y ambas especies llevan el gen que codifica la acumulación de colesteril éster transferencia proteína (CETP), que desempeña un papel central en lípido metabolismo, mientras que el CETP está ausente en los ratones y ratas5. Además, hámsteres desarrollan enfermedad hemorrágica más representativa de la manifestación humana después de la exposición al virus de Ebola6. Hámsters son también los modelos de elección para el estudio de ateroesclerosis7, carcinomas orales8y9de Miopatías inflamatorias. Recientemente, también ha sido demostrado que hámsteres son altamente susceptibles a la infección del virus Andes y hantavirus pulmonar síndrome-como enfermedad, proporcionando el modelo sólo roedor de los Andes virus infección10.
Para abordar la necesidad insatisfecha de novela genéticas modelos animales estudiar las enfermedades humanas donde no está disponible confiable modelo roedor pequeño, recientemente han tenido éxito en la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 para el hámster y han producido varias líneas de genética Ingeniería de hámsteres11. Cigotos de hámster son muy sensibles a medios ambientales que los protocolos de inyección PN desarrollados en otras especies no son adecuados. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para el hámster que se adapta a los requisitos especiales para la manipulación de embriones de hámster in vitro. Aquí, describimos el procedimiento de inyección PN detallado utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y las medidas de acompañamiento, desde la preparación del guía solo RNA (sgRNA) para la transferencia de embriones inyectados en hembras receptoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para aprovechar mejor el potencial de hámsters sirios dorados como modelos de enfermedades humanas, hemos desarrollado un protocolo de inyección de PN para entregar un CRISPR/Cas9 complejo para el genoma de hámster. El protocolo de inyección PN optimiza varias variables claves, incluyendo el medio de cultivo de embriones, la temperatura y longitudes de onda de luz13. También existen varios procedimientos de manejo de animales hamster específicos que deben seguir para la realización con éxi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en esta publicación fue apoyada por los institutos nacionales de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número 1R41OD021979 (a ZW) y por una beca de investigación de última generación BioGreen 21 Programa, República de Corea, subsidio no. PJ01107704 (a ZW) y subsidio no. PJ01107703 (a IK). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud o BioGreen 21. Agradecemos a Dr. Nikolas Robl para editar el manuscrito.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
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