Production de génétiquement Hamsters syriens dorés par Injection pronucléaire du complexe CRISPR/Cas9
Summary
Pronucléaire injection (PN) du cluster régulièrement entrecoupées courtes répétitions palindromiques (CRISPR) et le système CRISPR-associated protein-9 nucléase (CRISPR/Cas9) est une méthode très efficace pour produire génétiquement hamsters syriens dorés. Ici, les auteurs décrivent le protocole détaillé d’injection de PN pour la production des hamsters de knock-out du gène avec le système CRISPR/Cas9.
Abstract
La technique d’injection pronucléaire (PN) fut instituée chez les souris pour introduire le matériel génétique étranger dans les pronucléus des embryons au stade unicellulaire. Le matériel génétique introduit peut s’intégrer dans le génome embryonnaire et générer des animaux transgéniques avec des informations génétiques étrangers après le transfert des embryons injectées afin d’encourager les mères. Suite au succès à souris, injection PN a été appliquée avec succès dans beaucoup d’autres espèces animales. Récemment, injection PN a été avec succès employée pour introduire les réactifs avec les gènes modificateurs des activités, comme le système CRISPR/Cas9, de réaliser des modifications génétiques in sites dans plusieurs laboratoires et espèces animales de la ferme. En plus de maîtriser le spécial de microinjection compétences pour produire des animaux génétiquement modifiés par injection de PN, les chercheurs doivent comprendre la physiologie de la reproduction et le comportement de l’espèce cible, parce que chaque espèce présente unique défis. Par exemple, les embryons de hamster doré de Syrie ont unique manipulation conditions in vitro , tels que les techniques d’injection PN n’étaient pas possibles dans cette espèce jusqu’à récentes avancées par notre groupe. Avec notre protocole d’injection de PN espèces modifiées, nous avons réussi à produire plusieurs knock-out du gène (KO) et knockin hamsters (KI), qui ont été utilisés avec succès aux maladies humaines de modèle. Nous décrivons ici la procédure d’injection PN pour livrer le complexe CRISPR/Cas9 pour les zygotes du hamster, les conditions de manipulation des embryons, les procédures de transfert d’embryon, et élevage pour produire des organismes génétiquement modifiés hamsters.
Introduction
Le golden hamster syrien (Mesocricetus auratus) est l’un des rongeurs plus largement utilisés pour la recherche biomédicale. Selon le département américain de l’Agriculture, environ 100 000 hamsters ont été utilisés aux États-Unis en 2015, ce qui représente 13 % du total laboratoire animal son utilisation parmi les espèces couvertes par l’Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; consulté le 10 mars 2017).
Le hamster offre plusieurs avantages par rapport aux autres rongeurs dans l’étude d’un certain nombre de maladies humaines. Par exemple, les adénocarcinomes canalaire pancréatique histopathologie du N-nitrosobis(2-oxopropyl) amine (BOP) induit chez hamster est semblable à des tumeurs pancréatiques humaines, tandis que BOP traitement principalement induit des tumeurs de la glande thyroïde chez le rat et le poumon et les tumeurs du foie chez les 1de souris. Les hamsters sont le seul petit rongeur trouvé à l’appui de la réplication des adénovirus, elles sont aussi le modèle de choix pour le dépistage des vecteurs de base adénovirus oncolytiques et drogues anti-Adénovirus2,3,4. Un autre exemple dans lequel le modèle de hamster offre un avantage sur les rats et les souris est à l’étude de l’hyperlipidémie. Les humains et les hamsters présentent de grandes similitudes dans les voies métaboliques lipidiques et les deux espèces portent le gène codant cholesteryl ester transfert protéine (CETP), qui joue un rôle central dans les lipides métabolismes, tandis que CETP est absent chez les souris et les rats5. En outre, hamsters développent la maladie hémorragique plus représentative de la manifestation humaine après une exposition au virus Ebola virus6. Les hamsters sont également les modèles de choix pour l’étude de l’athérosclérose7, carcinomes orale8et myopathies inflammatoires9. Récemment, il a également été démontré que les hamsters sont très sensibles à l’infection par le virus Andes et développeront une maladie comme le syndrome pulmonaire hantavirus, fournissant le modèle seulement rongeur des Andes virus infection10.
Pour répondre aux besoins non satisfaits des nouveaux modèles animaux génétiques étudier les maladies humaines où n’existe aucun modèle de rongeur petit fiable, nous avons récemment ont réussi à appliquer le système CRISPR/Cas9 pour le hamster et ont produit plusieurs gammes de génétiquement Engineered hamsters11. Les zygotes hamster sont très sensibles aux milieux environnementaux tels que les protocoles d’injection PN développés chez d’autres espèces ne conviennent pas. Par conséquent, nous avons développé un protocole d’injection de PN pour le hamster qui tienne compte des exigences particulières pour la manipulation de hamster embryons in vitro. Nous décrivons ici la procédure d’injection PN détaillée en utilisant le système CRISPR/Cas9 et les étapes qui l’accompagne, de la préparation du seul guide RNA (sgRNA) pour le transfert des embryons injectés dans les femmes bénéficiaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour mieux exploiter le potentiel des hamsters syriens dorés comme modèles de maladies humaines, nous avons développé un protocole d’injection de PN pour la livraison d’un complexe de CRISPR/Cas9 pour cibler le génome de hamster. Le protocole d’injection PN optimise plusieurs variables clés, y compris le milieu de culture des embryons, la température et longueur d’onde de lumière13. Il y a également plusieurs procédures gestion animaux hamster spécifique à suivre pour mener ave…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par les National Institutes of Allergy et maladies infectieuses (NIAID) de la National Institutes of Health, sous attribution numéro 1R41OD021979 (à ZW) et par une subvention de recherche de la prochaine génération BioGreen 21 Programme, République de Corée, grant no. PJ01107704 (à ZW) et accorde le no. PJ01107703 (à IK). Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du National Institutes of Health ou BioGreen 21. Nous remercions m. Nikolas Robl pour l’édition du manuscrit.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
