CRISPR/Cas9 परिसर के परमाणु इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से इंजीनियर गोल्डन सीरियाई हंसटर का उत्पादन
Summary
नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic दोहराता (CRISPR) और CRISPR-जुड़े प्रोटीन-9 nuclease (CRISPR/Cas9) प्रणाली आनुवंशिक रूप से इंजीनियर गोल्डन सीरियाई हंसटर के उत्पादन के लिए एक अत्यधिक कुशल विधि है की परमाणु (PN) इंजेक्शन । इस के साथ साथ, हम CRISPR/Cas9 प्रणाली के साथ जीन नॉकआउट हंसटर के उत्पादन के लिए विस्तृत PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
परमाणु (PN) इंजेक्शन तकनीक पहले चूहों में एक सेल स्टेज भ्रूण के pronuclei में विदेशी आनुवंशिक सामग्री को लागू करने के लिए स्थापित किया गया था । शुरू की आनुवंशिक सामग्री भ्रूण जीनोम में एकीकृत कर सकते है और पालक माताओं को इंजेक्शन भ्रूण के हस्तांतरण के बाद विदेशी आनुवंशिक जानकारी के साथ ट्रांसजेनिक पशुओं उत्पंन करते हैं । चूहों में सफलता के बाद, PN इंजेक्शन कई अन्य जानवरों की प्रजातियों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है. हाल ही में, PN इंजेक्शन सफलतापूर्वक जीन-संशोधित गतिविधियों, जैसे CRISPR/Cas9 प्रणाली, कई प्रयोगशाला और कृषि पशु प्रजातियों में साइट विशेष आनुवंशिक संशोधनों को प्राप्त करने के लिए के साथ रिएजेंट शुरू करने के लिए नियोजित किया गया है । PN इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं का उत्पादन करने के लिए microinjection कौशल के विशेष सेट माहिर के अलावा, शोधकर्ताओं प्रजनन शरीर विज्ञान और लक्ष्य प्रजातियों के व्यवहार को समझना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक प्रजातियों अद्वितीय प्रस्तुत करता है चुनौतियों. उदाहरण के लिए, गोल्डन सीरियाई हंसटर भ्रूण इन विट्रो में अद्वितीय हैंडलिंग आवश्यकताओं है कि PN इंजेक्शन तकनीक संभव हमारे समूह द्वारा हाल ही में सफलताओं तक इस प्रजाति में नहीं थे । हमारी प्रजातियों-संशोधित PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल के साथ, हम कई जीन नॉकआउट (KO) और knockin (KI) हंसटर, जो मॉडल मानव रोगों के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है उत्पादन में सफल रहा है । यहां हम हंसटर के zygotes के लिए CRISPR/Cas9 परिसर पहुंचाने के लिए PN इंजेक्शन प्रक्रिया का वर्णन, भ्रूण हैंडलिंग शर्तों, भ्रूण हस्तांतरण प्रक्रियाओं, और आनुवंशिक रूप से संशोधित हंसटर उत्पादन के लिए आवश्यक पशुपालन ।
Introduction
गोल्डन सीरियन हंसटर (Mesocricetus auratus) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कुतर में से एक है । अमेरिका के कृषि विभाग के अनुसार, लगभग १००,००० हंसटर २०१५ में संयुक्त राज्य अमेरिका में इस्तेमाल किया गया, पशु कल्याण अधिनियम (http://www.aphis.usda.gov; तक पहुंचने में शामिल प्रजातियों के बीच कुल प्रयोगशाला पशु उपयोग के 13% का प्रतिनिधित्व मार्च 10, २०१७).
हंसटर मानव रोगों की एक संख्या के अध्ययन में अंय कुतर पर कई लाभ प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, एन के histopathology-nitrosobis (2-oxopropyl) अमीन (बीओपी) हंसटर में अग्नाशय डक्टर adenocarcinomas प्रेरित मानव अग्नाशय के ट्यूमर के समान है, जबकि बीओपी उपचार मुख्य रूप से चूहों और फेफड़ों और जिगर में ट्यूमर में थायराइड ग्रंथि ट्यूमर लाती है चूहे1. क्योंकि हंसटर केवल छोटे एडिनोवायरस की प्रतिकृति का समर्थन पाया कुतर रहे हैं, वे भी एडीनोवायरस-आधारित oncolytic वैक्टर और विरोधी एडीनोवायरस दवाओं के परीक्षण के लिए पसंद के मॉडल है2,3,4। एक और उदाहरण जिसमें हंसटर मॉडल चूहों और चूहों पर एक लाभ प्रदान करता है hyperlipidemia के अध्ययन में है । मनुष्य और हंसटर लिपिड चयापचय रास्ते में महान समानताएं प्रदर्शन और दोनों प्रजातियों में जीन एंकोडिंग cholesteryl एस्टर स्थानांतरण प्रोटीन (CETP) है, जो लिपिड चयापचय में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, जबकि CETP चूहों और चूहों में5में अनुपस्थित है ले । इसके अतिरिक्त, हंसटर रक्तस्रावी रोग Ebola वायरस के लिए जोखिम के बाद मानव अभिव्यक्ति के अधिक प्रतिनिधि का विकास6। हंसटर भी atherosclerosis7, मौखिक कार्सिनोमा8, और भड़काऊ myopathies9अध्ययन के लिए पसंद के मॉडल हैं । हाल ही में, यह भी दिखा दिया गया है कि हंसटर अत्यधिक Andes वायरस के संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील और हंटावायरस फुफ्फुसीय सिंड्रोम-रोग की तरह विकसित कर रहे हैं, Andes वायरस संक्रमण के केवल कुतर मॉडल प्रदान10।
के लिए unmet की जरूरत है उपंयास आनुवंशिक पशु मॉडल के लिए मानव रोगों का अध्ययन जहां कोई विश्वसनीय छोटे कुतर मॉडल उपलब्ध है पता करने के लिए, हम हाल ही में CRISPR/Cas9 प्रणाली को हंसटर के लिए लागू करने में सफल रहा है और आनुवंशिक रूप से कई लाइनों का उत्पादन किया है इंजीनियर हंसटर11। हंसटर zygotes अत्यधिक पर्यावरण milieus के प्रति संवेदनशील है ऐसी है कि PN इंजेक्शन अंय प्रजातियों में विकसित प्रोटोकॉल अनुपयुक्त हैं । इसलिए, हम हंसटर कि इन विट्रो मेंहंसटर भ्रूण हैंडलिंग के लिए विशेष आवश्यकताओं को समायोजित के लिए एक PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित की है । यहां, हम विस्तृत PN इंजेक्शन CRISPR/Cas9 प्रणाली और साथ कदम, एकल गाइड आरएनए (प्राप्तकर्ता महिलाओं में इंजेक्शन भ्रूण के हस्तांतरण के लिए sgRNA) की तैयारी से का उपयोग कर प्रक्रिया का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बेहतर मानव रोग के मॉडल के रूप में गोल्डन सीरियाई हंसटर की क्षमता का दोहन करने के लिए, हम एक CRISPR/Cas9 परिसर को हंसटर जीनोम लक्ष्य देने के लिए एक PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित की है । PN इंजेक्शन प्रोटोकॉल भ्रूण स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान इस प्रकाशन में रिपोर्ट एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) पुरस्कार संख्या 1R41OD021979 (ZW) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के द्वारा समर्थित किया गया था और एक शोध अनुदान द्वारा अगली पीढ़ी के ग्रीन 21 से कार्यक्रम, कोरिया गणराज्य, अनुदान सं । PJ01107704 (to ZW) और अनुदान सं. PJ01107703 (to इक). सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य या हरे रंग के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व 21 । पांडुलिपि के संपादन के लिए हम डॉ॰ निकोलास Robl का धन्यवाद करते हैं ।
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
