Produksjon av genmodifiserte Golden syrer Hamsters ved Pronuclear injeksjon av CRISPR/Cas9 komplekset
Summary
Pronuclear (PN) injeksjon av de klynget regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og CRISPR-assosiert protein-9 nuclease (CRISPR/Cas9) er en svært effektiv metode for å produsere genmodifiserte golden syrer hamsters. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon protokollen for produksjon av genet knockout hamstere med CRISPR/Cas9-systemet.
Abstract
Pronuclear (PN) injeksjon teknikken ble først etablert i mus å innføre genetisk fremmedlegemer i pronuclei av en celle scenen embryo. Introdusert arvestoffet kan integrere embryonale genomet og generere transgene dyr med utenlandske genetisk informasjon etter overføring av de injiserte embryoene å fremme mødre. Etter suksessen i mus, PN injeksjon er brukt med hell i mange andre dyrearter. Nylig PN injeksjon har vært ansatt å innføre reagenser med endring av genet aktiviteter, for eksempel CRISPR/Cas9 system, å oppnå områdespesifikke genetiske modifikasjoner i flere laboratorium, og gården dyrearter. I tillegg til mestring spesielle settet av microinjection ferdigheter å produsere genmodifiserte dyr av PN injeksjon, må forskere forstå reproduksjon fysiologi og atferd av målet artene, fordi hver art presenterer unike utfordringer. For eksempel golden Syrer hamster embryoer har unik håndtering krav i vitro slik at PN-injeksjon teknikker ikke var mulig i denne arten til siste gjennombrudd av vår gruppe. Med våre arter endret PN injeksjon protokollen, har vi lykkes i produksjon flere genet knockout (KO) og knockin (KI) hamsters, som har vært brukt med hell modell menneskelige sykdommer. Beskriver her vi PN injeksjon prosedyren for å levere CRISPR/Cas9 kompleks til zygotes hamster, fosteret håndtering forhold, fosteret overføring prosedyrer, og dyrehold kreves for å produsere genetisk endret hamstere.
Introduction
Golden Syreren hamster (Mesocricetus auratus) er en av de mest brukte gnagere for biomedisinsk forskning. Ifølge US Department of Agriculture, ble ca 100.000 hamstere brukt i USA i 2015, som representerer 13% av totale laboratorium dyr bruk blant artene som omfattes av det dyr velferd gjerning (http://www.aphis.usda.gov; tilgjengelig 10 mars 2017).
Hamster tilbyr flere fordeler sammenlignet med annet Red i studiet av en rekke menneskelige sykdommer. For eksempel histopatologi av N-nitrosobis(2-oxopropyl) Amin (BOP) indusert bukspyttkjertelen ductal adenocarcinomas i hamster ligner menneskelige bukspyttkjertelen svulster, mens BOP behandling hovedsakelig induserer skjoldbruskkjertelen svulster i rotter og lunge og leverskader svulster i mus1. Fordi hamsters er bare små gnagere grunnlegge for å oppbacking replikering av adenoviruses, er de også modell av valget for adenovirus-basert kan vektorer og anti-adenovirus narkotika2,3,4. Et annet eksempel hvor hamster modellen tilbyr en fordel over mus og rotter er i studiet av hyperlipidemi. Mennesker og hamstere viser stor likheter i lipid metabolske veier og begge arter bærer genet koding cholesteryl ester overføring protein (CETP), som spiller en sentral rolle i lipid metabolisms, mens CETP er fraværende i mus og rotter5. I tillegg utvikle hamstere hemorrhagic sykdommen mer representative for menneskelig manifestasjonen etter eksponering for Ebola-viruset6. Hamsters er også modeller av valget for å studere aterosklerose7, muntlig kreftsvulster8og inflammatoriske myopathies9. Nylig har det også vært vist at hamsters er svært utsatt for Andes virusinfeksjon og utvikle hantavirus lunge syndrom-lignende sykdom, gir bare gnager modell av Andes virus infeksjon10.
For å løse udekkede behov for romanen genetisk dyremodeller å studere menneskelige sykdommer der ingen pålitelig små gnagere modell er tilgjengelig, vi nylig har lyktes i å bruke CRISPR/Cas9 systemet til hamster og har produsert flere linjer med genetisk konstruert hamstere11. Hamster zygotes er svært følsom for miljømessige miljøer slik at PN injeksjon protokoller utviklet i andre arter er uegnet. Derfor utviklet vi en PN injeksjon protokoll for hamster som er tilpasset de spesielle kravene for håndtering av hamster embryo i vitro. Her beskriver vi detaljerte PN injeksjon prosedyren bruker CRISPR/Cas9 systemet og følger trinnene, utarbeidelse av enkelt støttelinje RNA (sgRNA) til å overføre injisert embryo i mottakerens kvinner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bedre utnytte potensialet i golden syrer hamsters som modeller for menneskelig sykdom, utviklet vi en PN injeksjon protokoll for å levere en CRISPR/Cas9 komplekse målrettingsland hamster genomet. PN injeksjon protokollen optimaliserer flere viktige variabler inkludert embryoet kultur medium, temperatur og bølgelengder av lys13. Det er også flere hamster-spesifikke dyr håndteringsprosedyrer må følge for å kunne gjennomføre genet målretting i hamster. For eksempel har seksuelt modnet kvinn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av National Institutes of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) av National Institutes of Health under prisen nummer 1R41OD021979 (å ZW) og et forskningsstipend fra neste generasjons BioGreen 21 Programmet, Sør-Korea, gir ingen. PJ01107704 (til ZW) og nei. PJ01107703 (til IK). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet av National Institutes of Health eller BioGreen 21. Vi takker Dr. Nikolas Robl for redigering manuskriptet.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
References
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
