في المختبر البلعمه حطام المايلين التي الضامة المشتقة من نخاع العظام
Summary
نقدم أساليب لتقييم قدرة متجولة الضامة مورين الأولية المشتقة من نخاع العظم استخدام الحطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين وتلطيخ الحبرية داخل الخلايا الدهنية.
Abstract
المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) هي الكريات البيضاء الناضجة التي تخدم دور حاسم فسيولوجية البالعات المهنية قادرة على مسح مجموعة متنوعة من الجسيمات. عادة، يتم تقييد بمدمس من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، ولكن بعد إصابة، سهولة التسلل. مرة واحدة داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي المصابين، بمدمس هي نوع الخلية الابتدائية المسؤولة عن الإزالة الحطام الخلوية المستمدة من الأذى، بما في ذلك كميات كبيرة من الحطام المايلين الغنية الدهن. تداعيات لاثيل بمدم التسلل والمايلين البلعمه الحطام داخل الجهاز العصبي المركزي معقدة وليست مفهومة جيدا. تسمح البروتوكولات المذكورة هنا، لدراسة مباشرة في المختبر من بمدمس في سياق إصابة الجهاز العصبي المركزي. نحن تغطي مورين بمدم العزلة والثقافة وإعداد الحطام المايلين، وفحوصات لتقييم بمدم المايلين الحطام البلعمه. هذه التقنيات إلى نتائج قابلة للقياس الكمي قوية دون الحاجة إلى معدات متخصصة هامة أو المواد، ولكن يمكن تخصيصها بسهولة لتلبية احتياجات الباحثين.
Introduction
المشتقة من نخاع العظم الضامة (بمدمس) حلقة وصل هامة بين نظم المناعة الفطرية والتكيف. مستضد تقديم الخلايا (Apc)، يمكنهم الاتصال مع الخلايا الليمفاوية عن طريق عرض كل مستضد وسيتوكين الإصدار1،،من23. ومع ذلك، وظيفتها الأساسية البالعات المهنية، لمسح مسببات الأمراض، والذين تتراوح أعمارهم بين الخلايا والحطام الخلوية1،4. بعد إصابة حبل الشوكي (علوم)، يتم إنشاء كميات كبيرة من الحطام المايلين من oligodendrocytes يحتضر، نوع الخلية مسؤولة عن الجهاز العصبي المركزي إكسون مييلينيشن5. نحن وآخرون أظهرت أن إزالة الحطام المايلين تقع أساسا على عاتق من التسلل إلى بمدمس5،،من67. ومع ذلك، ضمن إصابات النخاع الشوكي قد اقترح الإحاطة مواقع الحطام المايلين إزاحة هذه الخلايا للالتهابات عادة نحو8،5،دولة برو تحريضية9. وتعتبر بمدمس الوسطاء الرئيسيون لالتهاب الأعصاب في الحبل الشوكي المصاب، أهداف السريرية الهامة.
للمساعدة في التحقيق في تأثير بمدمس في الحبل الشوكي المصاب، قمنا بتطوير نموذج في المختبر لمباشرة دراسة كيفية الاستجابة بمدمس للحطام المايلين. تحسين أهمية بيولوجية، تستخدم كل من بمدمس مورين الأولية والحطام المايلين طازجة معزولة في هذه التحقيقات. على هذا النحو، بالتفصيل الأساليب المعروضة هنا أيضا بالعزلة وثقافة بمدمس موريني الأولية، وأسلوب تدرج سكروز معدلة المستخدمة لعزل الجهاز العصبي المركزي موريني المستمدة المايلين الحطام10،،من1112. الحطام المايلين يمكن أن توصف بسهولة مع صبغة فلورسنت، إستر سوكسينيميديل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE)، إلى المسار في استيعاب بمدمس. كفسي هو مناسبة تماما لهذا التطبيق لأنه غير-السامة للخلايا، ولها تصاريح الطيف الفلورسنت ضيقة الإرسال المتعدد مع غيرها الفلورسنت يسبر13،14. بعد البلعمه، تنقل عن طريق ليسوسوميس الدهون الحطام المايلين والمعلبة كمحايد الدهون داخل الخلايا الدهنية قطرات5. لتحديد مقدار هذا التراكم داخل الخلايا الدهنية، نقدم النفط الأحمر يا (أورو) تلطيخ الأسلوب الأمثل لتحليل الصورة الكمية. ينتج هذا الأسلوب المصبوغة بسيطة النتائج استنساخه قوية وتقدير حجم15. هذه الطرق تسهيل دراسة الحطام المايلين البلعمه والدهن الاحتفاظ مع محدودية المعدات المتخصصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الإجراءات المذكورة هنا CNS الخام الطازج معزولة المايلين الحطام والضامة الأولية المستمدة من نخاع العظام. لتقليل النفقات الحيوانية، نوصي بأن كلا العقول وأن تحصد خلايا نخاع العظام من كل الماوس في وقت التضحية. ويمكن إعداد اثنين من الباحثين يعملون معا كل من المواد في نفس الوقت. وبدلاً م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر جلين سانغر-هودجسون، “أخصائي وسائط الإعلام” في “كلية طب الاتحاد السوفياتي السابق” لكل عمله في إنتاج الفيديو وتحريرها والتعليق الصوتي.
وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” (R01GM100474 و R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
