במבחנה Phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים הנגזרות מח עצם
Summary
אנו מציגים שיטות כדי להעריך את יכולת phagocytic של ראשי מאתר הנגזרות מח עצם מקרופאגים באמצעות פסולת מיאלין fluorescently שכותרתו השומנים תאיים droplet מכתים.
Abstract
מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם לויקוציטים בוגרת לשרת תפקיד פיזיולוגי קריטיים כמו phagocytes מקצועי המסוגל סליקה מגוון של חלקיקים. בדרך כלל, BMDMs שנאסרת על מערכת העצבים המרכזית (CNS), אך בעקבות פציעה, הם בקלות יכולים לחדור. פעם אחת בתוך הרקמה הפצועים CNS, BMDMs הם סוג התא הראשי אחראי האישור של פציעה, נגזר הסלולר פסולת, כולל כמויות גדולות של פסולת המיאלין עשיר השומנים. ההשלכות neuropathological של BMDM חדירה של המיאלין פסולת phagocytosis בתוך מערכת העצבים הן מורכבות לא הבין היטב. הפרוטוקולים המתוארים כאן, לאפשר לחקר ישירה במבחנה BMDMs בהקשר של פגיעה CNS. אנחנו מכסים בידוד BMDM מאתר ואת התרבות המיאלין פסולת הכנה, מבחני להעריך BMDM מיאלין פסולת phagocytosis. טכניקות אלה לתוצאות לכימות חזקים ללא צורך משמעותי ציוד מיוחד או חומרים, עדיין ניתן בקלות להתאים אישית לצרכים של החוקרים.
Introduction
מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMDMs) הם חוליה חשובה בין מערכות החיסון מולדים, מסתגלת. כמו אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), הם יכולים לתקשר עם לימפוציטים באמצעות מצגת אנטיגן שני ולשחרר ציטוקין1,2,3. עם זאת, כמו המקצועי phagocytes, התפקיד העיקרי שלהם היא לנקות פתוגנים, תאים בגילאי ופסולת הסלולר1,4. בעקבות פגיעה בחוט השדרה (מדע), כמויות ניכרות של פסולת המיאלין נוצר מתוך oligodendrocytes גוסס, סוג התא אחראי על מערכת העצבים המרכזית האקסון myelination5. אנחנו ואחרים הראו כי סיווג של המיאלין פסולת הוא בראש ובראשונה באחריות שחדר BMDMs5,6,7. עם זאת, תוך פגיעה בחוט השדרה הוצע היבלעות באתרים של פסולת המיאלין להעביר תאים בדרך כלל אנטי דלקתיות אלה לכיוון מדינת פרו דלקתיים5,8,9. כמתווכים מרכזיים של נוירו-דלקת חוט השדרה נפגע, BMDMs הם מטרות קליני חשוב.
כדי לסייע לחקור את השפעת BMDMs בחוט השדרה הפגוע, פיתחנו מודל במבחנה ללמוד ישירות איך BMDMs להגיב המיאלין פסולת. כדי לשפר את הרלוונטיות ביולוגי, BMDMs מאתר ראשי ופסולת המיאלין מבודד טריים משמשים האלה החקירות. ככזה, השיטות המובאות כאן פירוט גם את הבידוד והתרבות של BMDMs מאתר ראשי, טכניקה הדרגתיות סוכרוז ששונה המשמשת כדי לבודד CNS מאתר נגזר המיאלין פסולת10,11,12. המיאלין פסולת יכול להיקרא בקלות עם תיוג הפלורסנט, אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), כדי מעקב אחר שלה הפנמה מאת BMDMs. CFSE מתאים היטב עבור יישום זה כי זה הלא-ציטוטוקסיות, היתרים ספקטרום פלורסנט הצר שלה ריבוב עם פלורסנט אחרים רגשים13,14. בעקבות phagocytosis, המיאלין פסולת שומנים מועברים דרך lysosomes, כחבילה ליפידים נייטרלי לתוך השומנים תאיים טיפות5. כדי לכמת את הצטברות השומנים תאיים, נציג של שמן אדום O (אורו) צביעת שיטת ממוטבים לניתוח תמונה כמותית. שיטה מכתימים פשוטה זו מייצרת תוצאות לשחזור חזקים כימות15. שיטות אלה להקל על המחקר של המיאלין פסולת השמירה phagocytosis ו ליפיד עם ציוד מיוחד מוגבל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליכים המתוארים כאן לנצל טרי מבודד פסולת המיאלין גולמי של CNS והן מקרופאגים הנגזרות מח העצם העיקרי. כדי לצמצם את ההוצאה על בעלי חיים, אנו ממליצים כי שני המוח, תאי מח העצם להיות שנקטפו כל עכבר בזמנו של הקרבה. שני החוקרים עובדים ביחד יכולים להכין שני חומרים בו זמנית. לחלופין, ניתן לאחסן את המוח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות גלן סנגר-הודג’סון, מומחה בתקשורת במכללה לרפואה של בריה”מ לשעבר על כל העבודה הפקות וידאו, עריכה, ואת הקריינות.
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01GM100474 ו- R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
