In Vitro Fagocitosi di residui del Myelin dai macrofagi derivate da midollo osseo
Summary
Vi presentiamo metodi per valutare la capacità fagocitica di primari macrofagi murini derivate da midollo osseo, utilizzando residui del myelin fluorescente contrassegnati e lipido intracellulare gocciolina macchiatura.
Abstract
Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono leucociti maturi che servono un ruolo fisiologico critico come fagociti professionali in grado di cancellare una varietà di particelle. Normalmente, BMDMs sono limitati dal sistema nervoso centrale (SNC), ma a seguito di un infortunio, essi possono facilmente infiltrarsi. Una volta all’interno il tessuto danneggiato del CNS, BMDMs sono il tipo di cellula primaria responsabile per la liquidazione del pregiudizio-derivato di detriti cellulari, tra cui grandi quantità di residui del myelin ricca di lipidi. Le ramificazioni neuropathological della fagocitosi BMDM infiltrazione e mielina detriti all’interno del SNC sono complesse e non ben compreso. I protocolli descritti qui, consentono lo studio diretto in vitro di BMDMs nel contesto della lesione dello SNC. Copriamo murino BMDM isolamento e cultura, preparazione di detriti di mielina e saggi per valutare la fagocitosi di detriti BMDM della mielina. Queste tecniche producono risultati quantificabili robusti senza bisogno di attrezzature specializzate significativa o materiali, eppure possono essere facilmente personalizzate per soddisfare le esigenze dei ricercatori.
Introduction
Derivate da midollo osseo macrofagi (BMDMs) sono un importante collegamento tra il sistema immunitario innato e adattivo. Come antigene che presenta le cellule (APC), possono comunicare con i linfociti tramite entrambi presentazione dell’antigene e rilascio di citochine1,2,3. Tuttavia, come fagociti professionali, la loro funzione primaria è di eliminare gli agenti patogeni, le cellule invecchiate e detriti cellulari1,4. A seguito di una ferita del midollo spinale (SCI), notevoli quantità di residui del myelin viene generato dai oligodendrocytes morente, il tipo di cellula responsabile della CNS assone mielinizzazione5. Noi ed altri abbiamo indicato che la liquidazione dei residui del myelin è principalmente la responsabilità di infiltrazione del BMDMs5,6,7. Tuttavia, all’interno di ferita del midollo spinale engulfment siti di residui del myelin è stato suggerito di spostare queste cellule antinfiammatorie normalmente verso un stato pro-infiammatorio5,8,9. Come mediatori chiave della neuro-infiammazione nel midollo spinale danneggiato, BMDMs sono obiettivi clinici importanti.
Al fine di studiare l’influenza della BMDMs nel midollo spinale danneggiato, abbiamo sviluppato un modello in vitro per studiare direttamente come BMDMs rispondere a residui del myelin. Per migliorare la rilevanza biologica, sia primario BMDMs murino e residui del myelin appena isolate sono utilizzati in queste indagini. Come tale, i metodi presentati qui dettaglio anche l’isolamento e coltura di BMDMs murino primario e derivato una tecnica gradiente di saccarosio modificate usata per isolare murino CNS mielina detriti10,11,12. Residui del myelin possono essere prontamente etichettato con un colorante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), per rilevare che l’internalizzazione di BMDMs. CFSE è adatto per questa applicazione perché è non citotossica e suoi permessi stretto spettro fluorescente Multiplexing con altri fluorescente sonde13,14. A seguito di fagocitosi, mielina detriti i lipidi sono trasportati attraverso i lisosomi e confezionati come lipidi neutri in goccioline di lipidi intracellulari5. Per quantificare questo accumulo di lipidi intracellulari, presentiamo un olio rosso O (ORO) che macchia il metodo ottimizzato per l’analisi quantitativa delle immagini. Questo semplice metodo di macchiatura produce robusti risultati riproducibili e quantificazione15. Questi metodi facilitano lo studio di ritenzione di fagocitosi e del lipido di detriti della mielina con limitate attrezzature specializzate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procedure descritte qui utilizzano entrambi appena isolato residui del myelin CNS grezza e macrofagi primari derivanti dal midollo osseo. Per ridurre le spese di animale, che si consiglia di entrambi i cervelli e le cellule del midollo osseo raccolte da ogni mouse al momento del sacrificio. Due ricercatori lavorano insieme possono preparare contemporaneamente entrambi i materiali. In alternativa, cervelli possono essere conservati a-80 ° C in PBS completati con antibiotici prima dell’isolamento di detriti di mielina….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist presso la FSU College of Medicine per tutta la sua opera nella produzione di video, l’editing e Voice-over.
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
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