In Vitro Fagocytose af Myelin resterne af knoglemarv-afledte makrofager
Summary
Vi præsentere metoder til at vurdere den fagocyterende kapacitet af primære murine knoglemarv-afledte makrofager ved hjælp af fluorescently mærket myelin debris og intracellulære lipid droplet farvning.
Abstract
Knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) er modne leukocytter, der tjener en kritisk fysiologisk rolle som professionelle fagocytter i stand til at rydde en bred vifte af partikler. Normalt BMDMs er begrænset fra centralnervesystemet (CNS), men efter en skade, kan de let infiltrere. Én gang inden for den tilskadekomne CNS væv, BMDMs er den primære type ansvarlig for regnskabsafslutning skade-afledte celleaffald, herunder store mængder lipid rige myelin debris. De neuropatologiske udløbere af BMDM infiltration og myelin vragrester fagocytose inden for CNS er komplekse og ikke godt forstået. De protokoller er beskrevet her, giver mulighed for direkte i in vitro -undersøgelse af BMDMs i forbindelse med CNS skade. Vi dækker murine BMDM isolation og kultur, myelin vragrester forberedelse og assays for at vurdere BMDM myelin vragrester fagocytose. Disse teknikker giver robust kvantificerbare resultater uden behov for betydelige specialiseret udstyr eller materialer, men let kan tilpasses til at imødekomme behovene hos forskere.
Introduction
Knoglemarv-afledte makrofager (BMDMs) er et vigtigt bindeled mellem de medfødte og adaptive immunforsvar. Som antigen præsentere celler (PMV’er), de kan kommunikere med lymfocytter via både antigen præsentation og cytokin frigive1,2,3. Men som professionelle fagocytter, deres primære funktion er at rydde patogener, alderen celler og celleaffald1,4. Efter en rygmarvsskade (SCI) genereres betydelige mængder af myelin vragrester fra døende oligodendrocytes, ansvarlig for CNS axon myelination5celletype. Vi og andre har vist, at clearance af myelin vragrester er primært ansvar infiltrerer BMDMs5,6,7. Men inden for rygmarvsskade websteder engulfment af myelin vragrester er blevet foreslået til at flytte disse normalt anti-inflammatoriske celler mod en pro-inflammatoriske tilstand5,8,9. Som centrale mediatorer af neuro-betændelse i såret rygmarven er BMDMs vigtige kliniske mål.
For at hjælpe med at undersøge BMDMs indflydelse i den skadede rygmarven, har vi udviklet en in vitro- model for at direkte studere hvordan BMDMs reagere på myelin debris. For at forbedre biologisk relevans, bruges både primære murine BMDMs og frisk isolerede myelin snavs i disse undersøgelser. Som sådan, de metoder, der præsenteres her også detaljeret isolation og kultur af primære murine BMDMs, og en modificeret saccharose gradient teknik bruges til at isolere murine CNS afledt myelin vragrester10,11,12. Myelin snavs kan let mærket med et fluorescerende farvestof, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), til at spore dens internalisering af BMDMs. CFSE er velegnet til dette program for det er ikke-cytotoksiske, og dens smalle fluorescerende spectrum tilladelser multiplexing med andre fluorescerende sonder13,14. Efter fagocytose, myelin vragrester lipider transporteres gennem lysosomer og pakkede som neutral lipider i intracellulære lipid dråber5. For at kvantificere denne intracellulære lipid ophobning, præsenterer vi en olie røde O (ORO) farvning metode optimeret til kvantitative billedanalyse. Denne enkle farvning metode producerer robuste reproducerbare resultater og kvantificering15. Disse metoder lette undersøgelsen af myelin vragrester fagocytose og lipid opbevaring med begrænset specialiseret udstyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
De procedurer, der beskrives her udnytter både frisk isolerede rå CNS myelin debris og primære knoglemarv-afledte makrofager. For at reducere dyrs udgifter, anbefaler vi, at både hjerne og knoglemarv celler høstes fra hver musen på tidspunktet for offer. To forskere, der arbejder sammen kan udarbejde begge materialer samtidig. Alternativt, hjerner kan opbevares ved-80 ° C i PBS suppleret med antibiotika før myelin vragrester isolation. Det har været vores erfaring, at hjerne kan opretholdes i disse betingelser f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist ved FSU College of Medicine for alle hans arbejde i video-produktion, redigering og voice-over.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01GM100474 og R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
