इन विट्रो अस्थि मज्जा द्वारा Myelin मलबे के Phagocytosis-व्युत्पंन मैक्रोफेज
Summary
हम वर्तमान विधियों प्राथमिक murine अस्थि मज्जा की phagocytic क्षमता का आकलन करने के लिए-फ्लोरोसेंट लेबल myelin मलबे और intracellular लिपिड छोटी बूंदों धुंधला का उपयोग मैक्रोफेज व्युत्पंन ।
Abstract
अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) परिपक्व ल्यूकोसाइट्स कि पेशेवर फ़ैगोसाइट कणों की एक किस्म समाशोधन में सक्षम के रूप में एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका की सेवा कर रहे हैं । आम तौर पर, BMDMs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से प्रतिबंधित कर रहे हैं, लेकिन एक चोट के बाद, वे आसानी से घुसपैठ कर सकते हैं । एक बार घायल सीएनएस ऊतक के भीतर, BMDMs प्राथमिक कोशिका प्रकार चोट के क्लीयरेंस के लिए जिंमेदार है-सेलुलर मलबे व्युत्पंन, लिपिड अमीर myelin मलबे की बड़ी मात्रा सहित । BMDM घुसपैठ और myelin मलबे के neuropathological असर सीएनएस के भीतर phagocytosis जटिल है और अच्छी तरह से समझ में नहीं आता । प्रोटोकॉल यहां वर्णित, सीएनएस चोट के संदर्भ में BMDMs के प्रत्यक्ष इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं । हम कवर murine BMDM अलगाव और संस्कृति, myelin मलबे की तैयारी, और परख BMDM myelin मलबे phagocytosis का आकलन करने के लिए । इन तकनीकों महत्वपूर्ण विशेष उपकरण या सामग्री के लिए की आवश्यकता के बिना मजबूत quantifiable परिणाम का उत्पादन, अभी तक आसानी से शोधकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी कर रहे हैं । antigen प्रस्तुत कक्षों (APCs) के रूप में, वे लिम्फोसाइटों के साथ दोनों antigen प्रस्तुति और cytokine रिलीज़1,2,3के माध्यम से संवाद कर सकते हैं । हालांकि, पेशेवर फ़ैगोसाइट के रूप में, उनके प्राथमिक समारोह रोगजनकों, वृद्ध कोशिकाओं, और सेलुलर मलबे1,4स्पष्ट करने के लिए है । एक रीढ़ की हड्डी की चोट (विज्ञान) के बाद, myelin मलबे की पर्याप्त मात्रा मरने oligodendrocytes से उत्पंन होता है, सेल प्रकार axon सीएनएस के लिए जिंमेदार5myelination । हम और दूसरों को पता चला है कि myelin मलबे की मंजूरी मुख्य रूप से BMDMs5,6,7घुसपैठ की जिंमेदारी है । हालांकि, रीढ़ की हड्डी में चोट साइटों myelin मलबे की समाई के भीतर एक समर्थक भड़काऊ राज्य5,8,9की ओर इन सामांय विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं को शिफ्ट करने का सुझाव दिया गया है । घायल रीढ़ की हड्डी में तंत्रिका-सूजन के प्रमुख मध्यस्थों के रूप में, BMDMs महत्वपूर्ण नैदानिक लक्ष्य हैं ।
घायल रीढ़ की हड्डी में BMDMs के प्रभाव की जांच करने में मदद करने के लिए, हम एक इन विट्रो मॉडल सीधे अध्ययन कैसे BMDMs myelin मलबे का जवाब करने के लिए विकसित किया है । जैविक प्रासंगिकता में सुधार करने के लिए, दोनों प्राथमिक murine BMDMs और हौसले से पृथक myelin मलबे इन जांचों में उपयोग किया जाता है । इस तरह के रूप में, यहां प्रस्तुत तरीके भी विस्तार अलगाव और प्राथमिक murine BMDMs की संस्कृति, और एक संशोधित सुक्रोज ढाल को murine myelin मलबे व्युत्पंन10,11,12को अलग इस्तेमाल किया तकनीक । Myelin मलबे आसानी से एक फ्लोरोसेंट डाई, carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल किया जा सकता है, internalization द्वारा अपने BMDMs को ट्रैक करने के लिए CFSE । यह गैर साइटोटोक्सिक है, और इसके संकीर्ण फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम परमिट है क्योंकि इस आवेदन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है अन्य फ्लोरोसेंट जांच के साथ division13,14. निम्नलिखित phagocytosis, myelin मलबे लिपिड lysosomes के माध्यम से ले जाया जाता है और intracellular लिपिड बूंदों में तटस्थ लिपिड के रूप में पैक5। इस intracellular लिपिड संचय यों तो, हम एक तेल लाल ओ (ओरो) दाग मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए अनुकूलित विधि प्रस्तुत करते हैं । यह सरल धुंधला विधि मजबूत प्रतिलिपि परिणाम और ठहराव15पैदा करता है । इन तरीकों myelin मलबे phagocytosis और लिपिड प्रतिधारण सीमित विशेष उपकरणों के साथ के अध्ययन की सुविधा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रक्रियाओं यहां वर्णित दोनों ताजा पृथक कच्चे तेल सीएनएस myelin मलबे और प्राथमिक अस्थि मज्जा का उपयोग-मैक्रोफेज व्युत्पंन । पशु व्यय को कम करने के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि दोनों दिमाग और अस्थि मज्जा को?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ग्लेन सैंज-Hodgson, चिकित्सा के FSU कॉलेज में वीडियो उत्पादन, संपादन में अपने सभी काम के लिए मीडिया विशेषज्ञ, और आवाज पर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01GM100474 और R01GM072611) ने समर्थन दिया था.
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
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