In Vitro Fagocytos av Myelin skräp av benmärgen-Derived makrofager
Summary
Vi presenterar metoder för att bedöma den fagocytos kapaciteten av primära murina benmärg-derived makrofager med fluorescently märkta myelin skräp och intracellulära lipid droplet färgning.
Abstract
Benmärg-derived makrofager (BMDMs) är mogna leukocyter som tjänar en kritiska fysiologiska roll som professionella fagocyter kan rensa en mängd partiklar. Normalt BMDMs är begränsade från det centrala nervsystemet (CNS), men efter en skada, kan de lätt infiltrera. En gång inom den skadade CNS-vävnaden, BMDMs är den primära celltypen ansvarar för clearance av skada-derived cellulära skräp, inklusive stora mängder lipid rika myelin skräp. BMDM infiltration och myelin skräp fagocytos inom CNS neuropatologiska förgreningar är komplexa och inte förstådda. De protokoll som beskrivs här, möjliggör direkt in vitro- studier av BMDMs i samband med CNS-skada. Vi täcker murina BMDM isolering och kultur, myelin skräp förberedelse och analyser för att utvärdera BMDM myelin skräp fagocytos. Dessa tekniker ger robust kvantifierbara resultat utan att behöva betydande specialiserad utrustning eller material, men kan enkelt anpassas för att möta behoven hos forskare.
Introduction
Benmärg-derived makrofager (BMDMs) är en viktig länk mellan medfödd och adaptiv immun system. Som antigen presenterande celler (APC), de kan kommunicera med lymfocyter via både antigen-presentation och cytokinfrisättning1,2,3. Dock som professionella fagocyter är deras primära funktion att rensa patogener, åldern celler och cellulära skräp1,4. Efter en ryggmärgsskada (SCI) genereras betydande mängder av myelin skräp från döende oligodendrocyter, celltypen som är ansvarig för CNS axon myelinisering5. Vi och andra har visat att clearance av myelin skräp är primärt ansvar infiltrera BMDMs5,6,7. Dock inom ryggmärgsskada har platser omvälvning av myelin skräp föreslagits för att skifta dessa normalt anti-inflammatoriska celler mot en pro-inflammatoriska tillstånd5,8,9. Som viktiga mediatorer av neuro-inflammation i den skadade ryggmärgen är BMDMs viktiga kliniska mål.
För att undersöka påverkan av BMDMs i den skadade ryggmärgen, har vi utvecklat en in vitro- modell för att direkt studera hur BMDMs reagerar på myelin skräp. För att förbättra biologiska betydelse, används både primära murina BMDMs och nymalen isolerade myelin skräp vid dessa undersökningar. Som sådan, de metoder som presenteras här detalj också isolering och kultur av primära murina BMDMs, och en modifierad sackaros gradient teknik används för att isolera murina CNS härrör myelin skräp10,11,12. Myelin skräp kan lätt märkas med ett fluorescerande färgämne, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), att spåra dess internalisering av BMDMs. CFSE är väl lämpad för det här programmet eftersom det är icke-cytotoxiska, och dess smala fluorescerande spektrum tillstånd Multiplexing med andra fluorescerande sonder13,14. Efter fagocytos, myelin skräp lipider transporteras genom lysosomerna och paketeras som neutrala lipider i intracellulära lipid droppar5. För att kvantifiera detta intracellulära lipid ackumulering, presenterar vi en olja Red O (ORO) färgning metod optimerad för kvantitativ bildanalys. Denna enkla färgningsmetod producerar robusta reproducerbara resultat och kvantifiering15. Dessa metoder underlätta studiet av myelin skräp fagocytos och lipid lagring med begränsad specialutrustning.
Protocol
Representative Results
Discussion
De förfaranden som beskrivs här utnyttja både färska isolerade rå CNS myelin skräp och primära benmärg-derived makrofager. För att minska djurens expenditures, rekommenderar vi att både hjärna och benmärgsceller skördas från varje mus vid tidpunkten för offer. Två forskare arbetar tillsammans kan förbereda båda materialen samtidigt. Alternativt, hjärnor kan lagras vid-80 ° C i PBS kompletteras med antibiotika innan myelin skräp isolering. Det har varit vår erfarenhet att hjärnor kan upprätthållas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Glenn Sanger-Hodgson, Media Specialist vid FSU College of Medicine för allt hans arbete i video produktion, redigering och voice-over.
Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R01GM100474 och R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
References
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M. Cytokines and macrophages. Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).
- Wang, X., et al. Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris. Glia. 63 (4), 635-651 (2015).
- Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study. J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).
- Greenhalgh, A. D., David, S. Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death. J Neurosci. 34 (18), 6316 (2014).
- Sun, X., et al. Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system. PLoS One. 5 (2), e9380 (2010).
- Gensel, J. C., Zhang, B. Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury. Brain Res. , 1-11 (2015).
- Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants. Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).
- Larocca, J. N., Norton, W. T. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Norton, W. T., Poduslo, S. E. Myelination in rat brain: method of myelin isolation. J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).
- Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells. Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).
- Kroner, A., et al. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).
- Trouplin, V., et al. Marrow-derived Macrophage Production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).
- Guo, L., et al. Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media. Mol Brain. 9 (1), 48 (2016).
- Bosco, D. B., et al. A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis. PLOS ONE. 12 (2), e0172925 (2017).
- Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).
- Fang, H., et al. Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP. J Immunol. 173 (1), (2004).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, (2008).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
