Praktiske hensyn i å studere metastatisk lungekreft kolonisering i Osteosarcoma bruker lunge metastasering analysen
Summary
Målet med denne artikkelen er å gi en detaljert beskrivelse av protokollen for lunge metastasering analysen (PuMA). Denne modellen tillater forskere å studere metastatisk osteosarcoma (OS) cellevekst i lungevev bruker widefield fluorescens eller AC confocal laserskanning mikroskopet.
Abstract
Lunge metastasering analysen (PuMA) er en ex vivo lunge explant og lukket celle kultur-systemet, som tillater forskere å studere biologi lunge kolonisering i osteosarcoma (OS) ved fluorescens mikroskopi. Denne artikkelen gir en detaljert beskrivelse av protokollen, og diskuterer eksempler på innhenting bildedataene på metastatisk vekst ved hjelp av widefield eller AC confocal fluorescens mikroskopi plattformer. Fleksibiliteten til PuMA modellen tillater forskere å studere ikke bare veksten av OS celler i lunge-microenvironment, men også å vurdere effekten av anti-metastatisk therapeutics over tid. AC confocal mikroskopi gir enestående og høy oppløsning bilder av OS celle interaksjon med lunge parenchyma. Videre PuMA modellen er kombinert med fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende protein genetisk journalister, kan forskerne studere lunge microenvironment, mobilnettet og subcellular, gen funksjon og promoter aktivitet i metastatisk OS celler. PuMA modellen gir et nytt verktøy for osteosarcoma forskere oppdage nye metastasering biologi og vurdere aktiviteten til romanen anti-metastatisk, målrettet terapi.
Introduction
Bedre utfall pediatriske pasienter med metastatisk osteosarcoma (OS) fortsatt kritisk udekket kliniske behov 1. Dette underbygger betydningen av å utvikle nye molecularly-målrettet terapi. Konvensjonelle chemotherapeutics som mål svulst celle spredning ikke har vist seg for å være effektive i behandling av metastatisk sykdom og dermed romanen strategier må mot selve metastatisk prosessen 2. Gjeldende artikkelen drøfter de praktiske sidene av en relativt ny type ex vivo lunge metastasering modell, lunge metastasering analysen (PuMA) utviklet av Mendoza og kolleger3, som gir nyttig verktøy i å oppdage nye molekylær drivere i lunge metastasering progresjon i OS 4,5. Før du fortsetter, men det ville være klokt å kort berører flere aktuelle modeller for metastasering, og hvordan PuMA modellen tilbyr flere fordeler sammenlignet med konvensjonelle i vitro søk.
Mest eksperimentelle modeller brukes til å studere metastasering utgjør i vitro og vivo systemer som recapitulate et bestemt trinn eller flere trinn i metastatisk kaskade. Disse trinnene omfatter: 1) kreftceller migrere fra den primære svulsten, 2) intravasation i nærliggende fartøy (blod og lymfatiske) og transitt i sirkulasjon, 3) arrestere på sekundær, 4) bloduttredelse og overlevelse på sekundære området, 5) dannelse micrometastases og 6) veksten i Stangeriaceae metastaser (figur 1). In vitro modeller av metastasering ha 2-dimensjonal (2D) overføring og 3-dimensjonale (3D) Matrigel invasjon analyser som er omtalt i detalj andre steder 6. I vivo modeller, de to brukte modell-systemene inkluderer: 1) den spontane metastasering modell er der en kreftceller er orthotopically injiseres i en bestemt vev type til en lokal svulst som spontant kaster metastatisk celler til fjerntliggende områder; 2) eksperimentelle metastasering modell er hvor kreftceller som injiseres i blodkaret oppstrøms av målet orgelet. For eksempel en hale vene injeksjon av tumor celler resultater i utvikling lunge metastaser5,7,8. Andre eksperimentelle metastasering modeller inkluderer injeksjon av kreftceller i milten eller hvem stemning som resulterer i utviklingen av leveren metastaser9,10. Praktiske hensyn til modellene i vivo er diskutert i detalj ved Welch 11. En annen i vivo modell brukes å studere metastasering i pediatric sarkomer er nedsatt nyre subcapsular svulst implantasjon modell som resulterer i lokale tumor formasjon og spontan metastasering til lungene 12,13. En mer teknisk krevende teknikk som intravital videomicroscopy kan visualisere direkte, i sanntid, interaksjoner mellom metastatisk kreftceller og microvasculature av et metastatisk nettsted (dvs. lungene eller leveren) som beskrevet av MacDonald14 og Entenberg15, eller kreft cellen bloduttredelse i chorioallantoic membranen som beskrevet av Kim 16.
PuMA modellen er en ex vivo, lunge vev explant, lukket kultur-systemet der veksten av fluorescerende kreftceller kan langs observeres via fluorescens mikroskopi over en periode på en måned (se figur 2A). Denne modellen viser den innledende stadiet av lungekreft kolonisering (trinn 3 til 5) i metastatisk kaskade. Store fordeler av PuMA modellen over konvensjonelle i vitro modeller er: 1) gir en mulighet til å måle langs metastatisk kreft cellevekst i en 3D microenvironment som beholder mange funksjoner i lunge microenvironment i vivo 3; 2) puMA lar forskeren å vurdere om knockdown av en kandidat genet eller narkotika behandling har anti-metastatisk aktivitet i forbindelse med en 3D lunge microenvironment; 3) PuMA modellen er fleksibel med mange typer fluorescens mikroskopi plattformer (figur 2B) som widefield fluorescens mikroskopi eller laser-skanning AC confocal mikroskopi vises eksempler på hver i figur 2C & D, henholdsvis. Denne artikkelen vil drøfte hvordan PuMA modellen til å anskaffe langsgående bildebehandling på metastatisk veksten av forbedret grønne fluorescerende protein (eGFP)-uttrykke, menneskelige høyt og lavt metastatisk osteosarcoma celler (MNNG og HOS cellene, henholdsvis) bruker lav forstørrelse widefield fluorescens. Eksempler på imaging en fluorescerende fargestoff som etiketter lunge parenchyma og en rød-fluorescerende protein genetisk reporter som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA modellen med AC confocal mikroskopi laserskanning er også diskutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Følgende tekniske artikkelen beskriver noen praktiske sider ved PuMA modellen i å studere lunge kolonisering i OS. Noen viktige skritt i protokollen der forskere bør ta ekstra forsiktighet omfatter følgende:
a) cannulation av trachea. Luftrøret kan lett skades mens dissekere den omkringliggende muskler og bindevev. I tillegg kan nålen av kateter lett bli presset gjennom luftrøret. Oppmerksom på hvordan skråkant nålen går inn i luftrøret ved innsetting av kanyle.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Arnulfo Mendoza som gitt opplæring i PuMA teknikken. I tillegg ønsker vi å erkjenne Dr. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), og Sam Aparicio (BC kreft Agency) for å gi bruk av sine mikroskoper i løpet av denne studien. Denne forskningen ble støttet (delvis) av Intramural forskningsprogrammet av National Institutes of Health, Center for Cancer Research, Pediatric Oncology avdeling. M.M.L. ble støttet av National Institutes av helse Intramural besøke andre Program (pris 15335), og støttes av en Joan Parker Fellowship i metastasering forskning. P.H.S. støttes av British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. . Quantitative stereology. , (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
