Summary
この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS) 細胞の成長の研究に研究を許可します。
Abstract
肺転移アッセイ (プーマ) は、肺植前のヴィヴォと閉じた細胞培養系蛍光顕微鏡による骨肉腫 (OS) で肺を植民地化の生物学を研究する研究者を許可します。この資料では、プロトコルの詳細な説明を提供し、広視野または共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して転移の成長上の画像データを得るの例について説明します。プーマ モデルの柔軟性により、肺微小環境の OS 細胞の成長だけでなく研究にも時間をかけて抗転移治療の効果を評価する研究者です。共焦点顕微鏡による肺実質と OS 細胞相互作用の前例のない、高解像度のイメージングが可能です。また、プーマ モデルを蛍光色素や蛍光タンパク質遺伝子記者と組み合わせれば、肺微小環境、細胞および細胞レベル下の構造、遺伝子機能および転移の OS 細胞におけるプロモーター活性研究者の研究することができます。プーマ モデルは、骨肉腫の研究者から新しい転移生物を発見し、新規抗転移、ターゲットを絞った治療法のアクティビティを評価するための新しいツールを提供します。
Introduction
転移性骨肉腫 (OS) の小児患者に対する改善結果重要な満たされていない臨床必要性1が残っています。これは、新しい分子標的療法の開発の重要性を強調します。ターゲット腫瘍細胞の増殖転移性疾患, とこのように新しい戦略の治療に有効であることを証明されていない従来の化学療法は2転移プロセス自体をターゲットする必要があります。現在の記事、メンドーサと同僚3、新しい発見に有用なツールを提供するによって開発された肺転移アッセイ (プーマ)前のヴィヴォ肺転移モデルの比較的新しいタイプの実用的な側面をについて説明しますOS 4,5で肺転移の進行で分子のドライバー。前に、しかし、転移、いくつかの現在のモデルは簡単に触れることが賢明だろう、試金する方法プーマ モデルは従来の in vitroでのいくつかの利点を提供しています。
特定のステップまたは転移の翼列のいくつかの手順を要約の in vitroとin vivoの系の転移を研究に使用される最も実験的モデルを構成します。これらの手順が含まれます: セカンダリ サイト、4) 血管外漏出およびセカンダリ サイト、5) 形成の生存で原発腫瘍、2) intravasation から移行して近くの血管 (血液あるいはリンパ管) との循環の中のトランジットに 1) 腫瘍細胞 3) 逮捕微小、および 6) の血管転移 (図 1) に成長。転移のin vitroモデルの 2 次元 (2 D) 移行を含めることができますで検討している 3 次元 (3 D) マトリゲル浸潤アッセイ細部6では別の場所で。生体内でモデルの 2 つの一般的なモデル システムが含まれます: 1)自然転移モデルは、腫瘍細胞ががん転移細胞を自発的に投げかけているローカル腫瘍を形成する特定の組織型に注入遠いサイト;2)実験的転移モデルは、標的臓器の上流血管に腫瘍細胞を注入するところです。たとえば、開発肺転移5,7,8で腫瘍細胞結果の尾静脈注射など。実験的転移の他のモデルには、脾臓や肝臓転移9,10の開発に起因する腸間膜静脈に腫瘍細胞の注入が含まれます。これらの体内モデルの実用的な考慮事項は、ウェルチ11で詳しく説明します。もう一つは、体内の小児肉腫の転移を研究するために使用モデルは、肺12,13ローカル腫瘍形成および自然転移で起因する腎の腎被膜下腫瘍移植モデルです。生体顕微鏡など技術的に厳しい技術直接視覚化に転移性癌細胞と転移巣の微細血管系のリアルタイム相互作用 (すなわち肺や肝臓) マクドナルド14 のとおり。と Entenberg15、または前述の金16漿尿膜にがん細胞浸潤。
プーマ モデルは肺組織植前のヴィヴォ、閉じた文化システム、蛍光腫瘍細胞の成長混入すること縦蛍光顕微鏡による 1 ヶ月の期間にわたって (図 2 a参照)。このモデルは、転移のカスケードの肺植民地化 (手順 3 から 5) の最初の段階を繰り返します。従来の in vitroモデル プーマ モデルのいくつかの主要な利点がある: 1) で縦肺微小環境の多くの機能を保持する 3 D の微小環境の転移性癌細胞の成長を測定する機会を提供しますvivo 3;2) プーマにより候補遺伝子や薬物治療のノックダウンは、3 D 肺微小環境; のコンテキストで抗転移活性を持つかどうかを評価するために研究員3) プーマ モデルは、柔軟性に蛍光顕微鏡プラットフォーム (図 2 b) 広視野蛍光顕微鏡やレーザー走査型共焦点顕微鏡などの多くの種類とそれぞれの例図 2開発、それぞれ。プーマ モデルを使用して強化された緑の蛍光蛋白質 (eGFP) の転移の成長に縦の画像データを取得する方法を説明します-表現する、人間の高と低転移性骨肉腫細胞 (MNNG、HOS 細胞それぞれ) を使用して低倍率広視野蛍光。肺実質をラベル蛍光染料と OS 内のミトコンドリアを分類する遺伝のレポーター細胞の共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いたプーマ赤色蛍光タンパク質のイメージングの例についても説明します。
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Protocol
画像データが得られた動物のすべてのプロトコルを動物愛護や国立がん研究所の利用委員会、国立衛生研究所の承認を得て行った。説明ビデオの資料に描かれているすべての動物プロトコルは、ブリティッシュ コロンビア大学動物の世話委員会によって承認されています。
1. 注入とプーマのモデルのための材料の腫瘍細胞の準備
注: ソリューションおよび細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。メディアのレシピは、表 1と表 2を参照してください。
- 中古 A メディア 37 oC の水のお風呂に 15 mL の円錐管に 5 mL を温めます。
- 1.2% 低融点アガロース ソリューション (滅菌水) ラボ電子レンジを使用してを溶かします。
- 溶融 agarose の 5 mL を 15 mL の円錐管に転送し、37 oC の水浴で保温します。37 oC と肺吸入工程の前に液体に溶かしたアガロースを確認します。
- 細胞培養グレード氷バケットに 1 X ペン/球菌を添加した PBS の事前チル 30 mL。
- 6 ウェル プレートの 1 つも前 B メディアの 1.5 mL でゼラチン スポンジを浸しなさい。スポンジは、肺のスライスのアンカーをサポートになります。
- OS 細胞が約 70-90% を確保する手術の日に合流。過剰合流またはメディアがオレンジから黄色のセルは通常を強調している、この時点での生存率を減少しているので、電池は使用しないでください。骨肉腫細胞株, MNNG、HOS、100 μ L のボリュームで 5 × 105 1 マウスの尾静脈に注入する使用されます。それに応じての高級以上のマウスを研究に使用する場合。
- 0.25% トリプシン-EDTA (3 mL T75 フラスコまたは 10 cm の培養皿で 2 mL) を使用して腫瘍細胞を収穫します。セルは、プレートから持ち上げて始めている、完全なメディアとトリプシン-EDTA を中和します。スピン ・ ダウン細胞と細胞培養グレード PBS で一度すすいでください。5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。
- 細胞数を標準的な方法で実行します。細胞懸濁液の損失はしばしば針ドロー アップ中に発生し、インジェクションの試みが失敗したので、何が実際に必要なより多くの細胞懸濁液を確認することをお勧めします。
- 細胞の生存率を評価するために細胞懸濁液のサンプルでトリパン ブルー排除分析を実行します。セルは、90% の生存率を示す場合にのみ続行またはより高い。
- 100 μ L のボリュームで 5 x 10 の5セルを挿入します。この金額の 2 倍の過剰を準備するには、1 x 10 の6セルにスピンダウン [HBSS の 0.2 mL で再停止されます。
- 注射用マウスを準備している間氷バケットに細胞懸濁液を配置します。
2. 尾静脈注射および肺吸入
注: このセクション中のソリューションと細胞量 1 マウスの十分であります。以上のマウスの研究で使用される場合、必要に応じてスケール アップ。機器、材料および次の手順で使用される手術器械のリストは、表 3 表 4を参照してください。
- 雌マウス (年齢 6-8 週間) を 5 分間加熱ランプの下で彼らの尾静脈より目に見えて明らかにするために暖かい。マウスの K7M2 や K12 セル使用 Balb/c マウス;MG63.3、mg 63、MNNG、HOS 細胞、重症複合免疫不全マウスを使用します。
- 細胞懸濁液がチューブを優しく揺することによって均一であることを確認します。慎重に 1 mL 注射器針なしに細胞懸濁液を作成します。キャップ注射器、27 ゲージの針。針ベベル針のボリュームのマーキングと同じ側にあることを確認します。
- 落にマウスを置き、アルコール ワイプでテールを綿棒します。
- 尾静脈注射を行い、細胞懸濁液 100 μ L を注入に進みます。注入後 5 分は CO2チャンバーにマウスを置き、安楽死の標準操作手順 (概要、制度上のアニマル ・ ケア委員会) を開始します。プロシージャは気管に損傷を与えるので、安楽死の手段として頚部転位を使用しない必要があります。
- マウスを解剖すると、一度は、アガロース/A-メディア ソリューションのマウス肺の吸入の層流フードの準備を開始します。層流フード内滅菌パッドとワークエリアを設定します。このパッドには、滅菌器具、IV カテーテル、IV 延長セット、重力灌流装置 (補足図 1を参照) を配置します。
- 背 recumbancy にマウスを配置します。滅菌の小さなハサミで慎重に胸腔内を公開する胸骨を分析します。アガロース/A-メディア ソリューションに肺を吹き込むために使用されるので、肺がパンクしないように注意します。
- 胸骨を切り裂く場合両側に胸郭入口過去気管を解剖します。周囲の軟部組織を離れて解剖で気管を公開します。
- 20 ゲージ IV カテーテルと気管を cannulate します。緩く ● キャニュレイテッド気管の周り滅菌腸線縫合糸を使用して外科的結び目を作る。
- カテーテル気管から重力灌流装置の 10 mL の注射器に設定 IV 拡張を取り付けます。
- 1:1 の混合物に、予め温めておいた 37 oC agarose (5 mL)、A メディア (5 mL) を組み合わせます。アガロース/A-メディア液を重力灌流装置の 10 mL の注射器に注ぐ。アガロース/A-メディア ソリューションを有する肺のガス注入前、拡張セットの全体の長さはアガロース/A-メディア、これにより空気と肺試料の不注意な吸入を否定でプライミングされてことを確認します。
- 肺が完全に充満するまで肺アガロース/A-メディア ソリューションを入力します。
- 肺が完全に充満、カニューレを削除、気管を通じて agarase/A-メディア液漏れを防ぐために手術の結び目をしっかりと縛る。
- 胸腔内から抜く (気管、心臓及び肺) を分析に進みます。肺の表面に損傷を与えるやない穿刺に注意してください。
- 場所中古冷蔵 30 mL の PBS で (ない特定の向き) で抜く 1 X ペン/連鎖球菌性、添加でき、20 分間を固めるアガロース/A-メディア。
- 高級はさみやピンセット、図 1 aに示すように、肺 (3 mm × 1.5 mm) の小さな断片をカットを使用してください。小さい肺のスライスは、2.5 X 目的を使用して簡単にイメージすることができます。複数のスライスは、実験条件ごとグループごと通常 4-10 スライス カットできます。
注:, 各実験群 B メディアにあらかじめ浸して 2 × 2 cm ゼラチン スポンジを含む個別井戸 (6 ウェル プレート) に肺のスライスを配置します。ウェルあたりのメディアの量は 1.5 mL をする必要があります。2-3 日毎にメディアを変更します。創薬研究、メディア/薬物を変更する頻度は決定ユーザーです。
3 肺のスライスと解析広視野蛍光イメージング
注: 広視野蛍光イメージング、小さくスライス、カット (3 × 1.5 × 1 mm) 肺セクションを 2.5 × 対物を使用して 1 つのイメージに合わせるため。
広視野の蛍光顕微鏡画像の取得:
- 通常、0、3、7、14 日間投与後に肺のスライスが作成されます。生物学的なキャビネットの無菌環境で慎重に転送肺のスライス、ゼラチンから滅菌 35 mm のガラス底にスポンジ丸皿。余分な水分はミラーとして機能し、腫瘍細胞からの蛍光光を反映して、肺のスライスから余分な水分を軽くたたくように注意します。
- 図 1 aに示されている同様の方法で肺のスライスを配置します。各列には、異なる実験条件を表すと思います。ない、肺のクロスをピンセットで汚染に注意してください。70% エタノールでリンスし、別の実験群から肺のスライスの処理前に乾燥します。
- 撮像パラメーターの最適化 (すなわち。 ゲイン、オフセット、露出時間、ビニング) 蛍光腫瘍細胞と制御 (放置車両) の肺組織を背景と最高のコントラストを提供するグループです。制御グループから同じパラメーターを使用して、実験群をイメージします。Tiff 画像形式として保存します。
- スケールの参考のためには、同じ目的でマイクロメータのデジタル写真を撮る。
- 肺自己蛍光が変わるので撮像パラメーターする必要があります調整するコントロールの肺に各撮像セッション。1 つのセッションのため撮像パラメーター必ずしも最適の後続のイメージング セッション。
画像解析:
注: 次の画像処理手順は、ImageJ 1.51 h ソフトウェア パッケージ17で行われます。
- ImageJ (図 3 a) で画像ファイルを開きます。
- 背景を減算: プロセス > 引く背景 > ローリング ボール半径 (50 ピクセルで開始)、「光の背景」(図 3 b) オフにします。
- 画像を 8 ビットの形式に変換: 画像 > タイプ > 8 - ビット (図 3)。
- 単位をピクセルに設定: 画像 > Enter「ピクセル」単位の長さで「ピクセル幅」「ピクセルの高さ」、「ボクセルの深さ」1 を入力。後続の画像に適用する「グローバル」ボックスをを確認します。
- 多角形選択ツールを使用して、全体の肺のスライスの形をアウトラインし、総肺のスライスの領域 (ピクセル2) を決定します。この値は、肺の腫瘍パーセント負担の計算に使用されます。
- しきい値画像: イメージ > 調整 > しきい値 >"Default"と"B & W"を強調表示 > 腫瘍のセルの大部分を正確に強調表示するようなイメージのしきい値スライダーを使用します。「適用」を押すと、肺はすべて黒、蛍光の病変は白い黒と白のイメージになります (図 3 D)。2 回の「適用」を押すと、イメージのすべての蛍光灯の構造が黒い図形 (図 3E) で、今を反転します。
- 数と病変の形状の定量化:
分析 > 測定を設定 >「領域」を確認してください。他のすべてのボックスをオフにします。
粒子を分析 > サイズ (ピクセル2): 0-無限は ImageJ を列挙する図形の範囲を表します。0 日目車両画像の単一腫瘍細胞とみなされる最小の病変は経験的に判断します。データ セット内の残りの画像の下限値としてこの単一の腫瘍のセルの領域を使用します。本書で挙げた仕事のため 11 ピクセル2が下限値として設定されます。ビデオの例で提示いただき、24 ピクセル2が下限値として設定されます。「真円度」の範囲 0-1 のまま。設定することができます「表示」「何も」。また、「ショー」と「アウトライン」を選択すると、すべて形状アウトライン描画が生成されます。別のウィンドウにポップアップする測定の結果の表示] をチェックします。必要に応じて、チェック「マネージャーに追加」ボックスを持つすべての図形は、将来の参照用に保存できる ROI マネージャーに定量化が保存されます。OK を押すと、「結果」ウィンドウがポップアップすべての列挙された図形と面積 (図 3 f) を含みます。 - コピーして「結果」ウィンドウからデータをスプレッドシートに貼り付けます。Excel で合計数学関数を使用して、その特定の肺のスライスの転移巣のすべての領域の合計します。肺のスライスのパーセント肺腫瘍負荷を評価するために肺のスライスの面積によって病変の面積の合計を分割します。このパラメーターはまたとして知られている面積率 (A) 記述されているアンダーウッド18によってさらに。
肺腫瘍の負担 = 肺のスライスの転移巣エリア/総面積の合計 - コントロール グループおよびグループの残りの肺セクションの残りの部分の肺腫瘍負荷を計算します。0、3、7、14 日間 1 グループあたり平均肺腫瘍量をプロットします。進歩的な時点でプーマ モデルで成長している高低転移 OS 細胞の代表広視野蛍光写真 (図 4 a) のとおりです。パーセントの転移性腫瘍の負担で一定期間 (0 日目に正規化) フォールドの変更を示す線グラフを表示 (図 4 b)。
4 プーマ モデルの共焦点蛍光イメージング
注: 共焦点イメージングのためティッシュの処理は、前のセクションと同様以外大きい肺のスライスは、イメージを作成するより多くの Roi を許可する (完全な横断、1-2 mm 厚) がカットされます。
DAR4M 肺組織のラベル。
- 37 ° C で 45 分間 (HBSS) で DAR4M の 10 μμM の肺のスライスを浸すDAR4M は、肺の細胞内活性窒素種をラベル付けします。
- インキュベーションの 45 分後に、新鮮な HBSS と肺のスライスをすすいでください。
- 丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。
- 図 5に示す例の画像撮像パラメーターの表 5のとおりです。
- 関心領域の Z スタックを取得します。ナイキスト ・ サンプリングの推奨の Z スライス厚を使用します。DAR4M ラベルの肺組織に緑色蛍光 OS セルを表示する 3 D スタックの代表的な映画は、映画 1と補足的な映画 1で提供されます。
例の共焦点画像を図 5に示すように、イメージング セッションをターミナルでした。生活に少ない光損傷があるので縦イメージングが必要な場合、2 光子または多光子の整った LSM 顕微鏡イメージングのための使用はお勧め組織19,20。
プーマ モデルで水戸 RFP 発現 mg 63 細胞のイメージング。
- ステップ 1 や水戸 RFP 作成を表現する mg 63 セルを用いた 2 でアウトラインとしてプーマ プロトコルを実行します。
- 丸皿、共焦点顕微鏡の画像 35 mm のガラス底で肺のスライスを配置します。
- 図 6に示す例の画像撮像パラメーターの表 6のとおりです。映画 2の補足の映画 2蛍光ミトコンドリアを提供の赤と緑の蛍光 OS 細胞を示す 3 D スタックの代表的な映画。
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Representative Results
低倍率広視野蛍光顕微鏡
プーマ肺のスライスの広視野蛍光顕微鏡、代表的な画像と定量化データは図 2、および図 4 aとBで示されています。高と低転移細胞の転移の性癖は進行時間のポイントを視覚的に明らかにされます。効率的に、MNNG セルは、HOS 細胞がすべて育つことができないに対し肺組織を植民地化できます。画像解析から図 4 bのグラフで示すように、時間をかけて成長を評価する定量的なデータを取得できます。1 つのイメージで全体の肺のスライスをキャプチャするために低倍率 (2.5 X) で取得お勧めします。このメソッドは、大きい番号のプーマ スライスのバッチ画像処理を許可します。
高倍率共焦点蛍光顕微鏡
プーマ肺のスライスの共焦点顕微鏡の代表的なイメージは図 5のとおりです。個々 の eGFP 発現 mg 63 細胞は図 5 bの DAR4M 蛍光色素でラベル付け肺実質に関連して図 5 aで見ることができます。マージされた画像の図 5と拡大で表示されます容器内蛍光腫瘍細胞のイメージは図 5に示すように。図 5と 5 D の 3 D 映画は映画 1および補足の映画 1にそれぞれ表示されます。ミトコンドリアは、のように、細胞内構造の共焦点イメージング図 6 。ゾル性細胞質の eGFP 発現により、図 6 a、アウトライン腫瘍細胞と RFP の付いたミトコンドリアが図 6Bに示されています。マージされたイメージは、図 6に見られます。図 6の 3 D 映画は、映画 2および補足の映画 2のとおりです。ミトコンドリアなど細胞レベル下の構造のイメージングは、転移の OS 細胞における細胞小器官の生物学を勉強する他の蛍光ラベルと組み合わせることができます。複数のラベルを追加するときは、レーザー ラインと排ガス浄化装置は興味の特定の蛍光体/蛍光蛋白質と互換性があるを確認します。イメージング fluorophores/蛍光タンパク質の励起・発光スペクトルは密接に重複を避けてください。
図 1: 転移のカスケードを示す図。転移のカスケードは、複数の率制限ステップに分けることができます。(1) 転移性腫瘍細胞の原発腫瘍部位を残して; ローカルの実質に侵入し、(血液・ リンパ容器に循環; 中のトランジット 2) 腫瘍細胞 intravasating(セカンダリ サイトで 3) 腫瘍細胞の逮捕(血管セカンダリ サイトで生存からを 4) 腫瘍細胞浸潤(微小; への成長 5)(6) 血管のあからさまな転移性腫瘍に成長。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 広視野蛍光と共焦点蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用してイメージング プーマ肺スライス。(例 A) プーマ スライスは、ガラス底 35 mm ディッシュに表示されます。(B) 共焦点顕微鏡装置。(OS の eGFP 発現細胞とプーマ スライスの例 C) 低倍率イメージ。縮尺記号 = 0.5 mm。 (D) プーマ スライスのサブ領域の例のコンフォーカル画像。縮尺記号 = 100 μ m。(*)肺実質赤 DAR4M でラベル付け (埋め込みを参照してください)、(▼) mg 63 の eGFP 発現細胞を指します。縮尺記号 = 30 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ImageJ を用いたプーマ スライスの低倍率画像を処理します。(A) 元プーマのイメージ。(B) バック グラウンド減算。(C) 8 ビット イメージに変換します。(D) しきい値画像蛍光腫瘍のセルを強調表示します。(E) イメージの反転。(F) 離散図形と図形領域の定量化の列挙体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.時間をかけてプーマ モデルにおける細胞の高と低転移人間 OS の成長を示す低倍率シリアル画像。(A) シリアル転移性の高い MNNG 細胞と低転移 HOS 細胞像は、0、3、7、14 日間投与後に表示されます。MNNG 細胞、HOS 細胞と対照をなして肺微小環境で良く育ちます。縮尺記号 = 1 ミリメートル。 (B) フォールド-の変更を時間をかけて MNNG、HOS 細胞のパーセントの転移性腫瘍の負担が線グラフで表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: DAR4M ラベル プーマ肺のスライスの共焦点顕微鏡。DAR4M ラベルの付いたプーマ肺組織の eGFP 発現 mg 63 細胞の代表的な共焦点画像。(EGFP 発現 mg 63 細胞 (▼) を示す A) グリーン チャンネル。(B) 赤のチャネルは、肺実質の細胞における活性窒素種へのバインド DAR4M 色素を示します。染料は肺実質をハイライト (#)、および血管 (*) に似た構造。肺セクションはプーマの端には、(↓) が示されます。(C) 合併の緑と赤のイメージ。縮尺記号 = 100 μ m。(D) (C) から点線の白いボックスの拡大した画像は、容器内の腫瘍細胞を示しています。縮尺記号 = 50 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: プーマ モデルの骨肉腫細胞におけるミトコンドリアの共焦点顕微鏡。Mg 63 の eGFP 発現細胞におけるミトコンドリアの代表的な共焦点画像。(EGFP 発現 mg 63 細胞 (▼) を示す A) グリーン チャンネル。(ミトコンドリア (*) にローカライズされた RFP を表示 B) 赤のチャネル。(C) 合併の緑と赤のイメージ。縮尺記号 = 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 文化メディア | レシピ |
| 完全なメディア (500 mL) | •440 mL DMEM |
| 50 mL FBS | |
| X ペン/連鎖球菌性ソリューション (10000U/mL) • 5 mL 10 | |
| • 5 mL L-グルタミン (200 mM) | |
| A メディア (250 mL) | •177.58 mL の滅菌水 |
| 50 mL 10 倍速 M-199 メディア | |
| • 15 mL 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液 | |
| 50 mM hydrocortizone •2.25 mL | |
| •125 mL 0.4 mg/ml レチノール酢酸 (滅菌水) | |
| ペン/連鎖球菌性ソリューション (10000U/mL) X 10 の • 5 mL | |
| 10 mg/ml ウシ インスリン 50 mL | |
| B メディア (500 ml) | •427.6 mL の滅菌水 |
| 50 mL 10 倍速 M-199 メディア | |
| • 15 mL 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液 | |
| 50 mM hydrocortizone •2.25 mL | |
| •125 mL 0.4 mg/ml レチノール酢酸 (滅菌水) | |
| ペン/連鎖球菌性ソリューション (10000U/mL) X 10 の • 5 mL | |
| 10 mg/ml ウシ インスリン 50 mL |
テーブル 1。完全なメディアのためのレシピ、B-メディアのメディア。細胞培養のためのレシピとプーマの試金のためのメディアが表示されます。
| 細胞培養用試薬 | 説明 | カタログ ナンバー | 会社 |
| MNNG HOS | 転移性の高い OS セルライン | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | 悪い転移 OS セルライン | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | 転移性の高い OS セルライン | N/A | エイミー ・ ルブラン研究所 (NCI) |
| MG 63 | 悪い転移 OS セルライン | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 メディア | A メディア、B-メディア ベース メディア | 11825015 | Thermofisher |
| 蒸留水 (滅菌) | A メディアのコンポーネント ・ | 15230 147 | Thermofisher |
| B メディア | |||
| 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液 | A メディアのコンポーネント ・ | 25080094 | Thermofisher |
| B メディア | |||
| Hydrocortizone | A メディアのコンポーネント ・ | H6909 | シグマ Alrich |
| B メディア | |||
| レチノール酢酸水が水溶性 | A メディア & B メディアの構成 | R0635 5 MG | シグマ Alrich |
| 集中 (10000 U/ml) X 10 のペニシリン/ストレプトマイシン液 | A メディアのコンポーネント ・ | 15140122 | Thermofisher |
| B-メディア、完全なメディア | |||
| ウシのインスリン溶液 (10 mg/ml) | A メディアのコンポーネント ・ | I0516 5 ML | シグマ Alrich |
| B メディア | |||
| DMEM、高グルコース | 完全なメディアの基本メディア | 11965092 | Thermofisher |
| L-グルタミン (200 mM) | 完全なメディアのコンポーネント | 25030081 | Thermofisher |
| ウシ胎児血清 | 完全なメディアのコンポーネント | 16000044 | Thermofisher |
| ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 | 細胞培養で使用 | 14190144 | Thermofisher |
| ハンクの緩衝塩液、ないカルシウム、ないマグネシウム、フェノール赤なし | 注入前に細胞ペレットを再懸濁しますに使用 | 14175095 | Thermofisher |
| トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド | 細胞培養で使用 | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | 肺実質のラベルに使用 | ALX-620-069-M001 | エンツォ |
表 2。A メディア、B-メディア、文化試薬を携帯し、メディアを完了します。メディアのレシピ ・試薬・ バッファー用のコンポーネント カタログ番号や会社名が付いています。
| 材料 | 説明 | カタログ ナンバー | 会社 |
| ツァイス 710 共焦点 LSM | 直立 LSM 共焦点顕微鏡 | N/A | ツァイス |
| ツァイス 780 共焦点 LSM | 倒立 LSM 共焦点顕微鏡 | N/A | ツァイス |
| SCID マウス | うなずく。CB17-Prkdcscid/NcrCrl では、女性の年齢 6-8 週間 | N/A | チャールズ川 |
| 弁 | 肺ティッシュ セクションのサポートとして使用 | 59-9863 | ハーバード装置 |
| SeaPlaque アガロース | 肺吸入時に使用 | 50100 | ロンザ |
| 1 ml 注射器 27 ゲージ針 | 尾静脈注射用 | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml 注射器 | 肺吸入用 | 309604 | BD |
| 20 ゲージ カテーテル | 肺吸入時に使用 | SR OX2032CA | テルモ |
| アボット エクス テンション セット (30"、無菌) | 肺吸入時に使用 | 8342 | Medisca |
| アルコール綿棒 | 尻尾を拭くため静脈注射の前に | 326895 | BD |
| 滅菌手術用手袋 | マウス肺の処理を Asceptic | サイズにより異なります | Fisherscientific |
| 30 cm 定規 | 肺吸入用 | ステープル | |
| ルーラーのサポート スタンド | 肺吸入用 | HS29022A | Pipette.com |
| 35 mm ガラス底培養皿 | 肺のスライスのイメージング中に使用 | 81158 | Ibidi |
| 防水防湿層と吸収性 Underpads | 生体フード内の滅菌作業領域を使用 | 56617 014 | VWR |
| プレーン腸線縫合糸 | ● キャニュレイテッド気管を縛るため | N/A | ブラウン |
表 3。ピューマのための材料。プーマ プロトコルに必要な材料がカタログ番号や会社名で表示されます。
| 材料 | 説明 | カタログ ナンバー | 会社 |
| 3.5「まっすぐシャープ/シャープ マイクロ解剖はさみ | 切削肺セクション | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) 長くまっすぐ鋸歯状余分な繊細な 0.5 mm の先端 | 操作/持株肺セクション | RS-5132 | Roboz |
| 4 インチ (10 cm) 長い鋸歯状のわずかなカーブ 0.8 mm の先端 | 操作/持株肺セクション | RS5135 | Roboz |
| 親指のドレッシング鉗子。鋸歯状にされた;繊細です;4.5"長さ;先端幅 1.3 mm | 一般的な郭清の | RS-8120 | Roboz |
| 親指の鉗子 4.5"は鋸歯状 2.2 mm 先端幅をドレッシング | 一般的な郭清の | RS-8100 | Roboz |
| 極細マイクロ解剖はさみ 3.5"まっすぐシャープ シャープ、20 mm ブレード | 一般的な郭清の | RS-5880 | Roboz |
| ナップはさみ;まっすぐに;シャープ ・ ブラント。27 mm ブレード長さ;4「全体の長さ | 一般的な郭清の | RS-5960 | Roboz |
表 4。プーマの手術器具も。プロトコルで使用される様々 なステンレス製器具カタログ番号や会社名が付いています。
| パラメーター | 488 レーザー | 561 レーザー | |
| 目的 | ツァイス W N-Achroplan 10 x/0.3 W (DIC) M27 | ||
| 電源 | 2% | 2% | |
| ピクセル ドエル | 1.61 | 1.61 | |
| 平均 | 0 | 0 | |
| ズーム | 1 | 1 | |
| マスターの利得 | 820 | 814 | |
| デジタルゲイン | 1 | 0.51 | |
| デジタル オフセット | -4.5 | -9.24 | |
| ピンホール | 51 | 57 | |
| 波長可変フィルター | 496-553 | 570-618 | |
表 5。プーマの DAR4M というラベルの付いたセクションの共焦点イメージングのためのパラメーターです。特定のイメージのパラメーターが現在の紙の共焦点画像を取得するために使用は、テーブルで提供されます。
| パラメーター | 488 レーザー | 561 レーザー | |
| 目的 | プラン ・ アポクロマート 63 x/1.40 油 DIC M27 | ||
| 電源 | 2% | 2% | |
| ピクセル ドエル | 0.6 | 0.6 | |
| 平均 | 2 (線) | 2 (線) | |
| ズーム | 2.3 | 2.3 | |
| マスターの利得 | 449 | 390 | |
| デジタルゲイン | 1 | 1.23 | |
| デジタル オフセット | 0 | 0 | |
| ピンホール | 136 | 136 | |
| 波長可変フィルター | 493-550 | 566-703 | |
表 6。プーマのセクションで mg 63 細胞のミトコンドリアの共焦点イメージングのためのパラメーターです。特定のイメージのパラメーターが現在の紙の共焦点画像を取得するために使用は、テーブルで提供されます。
補足図 1: 重力灌流装置。重力灌流装置は、H20 静水圧の 20 cm で液体のアガロース/A-メディア ソリューションで肺を吹き込むために使用されます。アガロース/A-メディア ソリューションは、(表示されていません) ● キャニュレイテッド気管セット IV の拡張機能によって接続されている 10 mL 注射器に注がれています。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
映画 1: DAR4M ラベル プーマ肺スライスにおける細胞の eGFP 発現 OS の 3 D 共焦点 z スタック画像回転します。DAR4M (赤のチャネル) を使用する目的は肺実質と mg 63 の eGFP 発現細胞も見られる (グリーン チャンネル) をすることができます。縮尺記号 = 100 μ m。この動きをダウンロードするここをクリックしてください。
映画 2: プーマ モデルにおける細胞の eGFP 発現 OS RFP ラベル ミトコンドリアの 3 D 共焦点 z スタック画像回転します。ミトコンドリアなどの細胞小器官がプーマ モデルの eGFP 発現 mg 63 細胞 (グリーン チャンネル) で RFP (赤いチャネル) とラベル表示されます。縮尺記号 = 10 μ m。この動きをダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 1: 肺の容器内転移 OS 細胞の拡大された 3 D 映画。内肺微小血管に eGFP 発現 mg 63 セルを示します。縮尺記号 = 30 μ M。この動きをダウンロードするここをクリックしてください。
補足映画 2: 肺の転移の OS 細胞内のミトコンドリアの拡大された 3 D 映画。RFP の付いたミトコンドリアは肺微小環境の mg 63 セルに表示されます。縮尺記号 = 5 μ M。この動きをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
次の技術資料では、OS で肺を植民地化の勉強にプーマのモデルのいくつかの実用的な側面について説明します。研究者が細心の注意を取る必要がありますプロトコルのいくつかの重要なステップは次のとおりです。
) の気管カニューレ装着。気管は、周囲の筋肉や結合組織を解剖しながら簡単に破損することができます。さらに、カテーテルの針は気管を通じて簡単にプッシュできます。カニューレを挿入するときに、針のベベルが気管を入力する方法に細心の注意を払います。
b) 穴をあけるか、肺の表面を損傷します。肺を簡単にパンクしたか胸骨を除去し、胸腔内を公開するはさみを解離性大破損することができます。胸腔内から抜くうち解離性に注意します。穴をあけるまたは肺の表面の損傷、液体アガロース/A-メディアに漏れ出してと肺はデフレートされます。
c).をイメージしながら余分なメディアを肺セクションから削除します。周囲の肺セクション余分な液体メディアは、顕微鏡下で見たときは、「ミラー」効果を引き起こす可能性が。余分な液体はそれにより画像の蛍光領域を誇張して腫瘍細胞から蛍光灯の光を反映できます。余分なメディアの流体の除去はイメージでこのアーティファクトを防止します。また、画像の後処理中にイメージのアーティファクトを削除できます。
d) 生体組織の光損傷。水銀電球や 1 光子励起顕微鏡のレーザーを使用している場合必ず、光にさらされる時間を制限します。光の強さ/電源割合も軽減できます。光の源への露出過度は、肺組織に光損傷を引き起こす可能性が。顕微鏡は、発光ダイオード (LED) を装備または縦断的イメージングの研究中に少ない光損傷を作り出すので、顕微鏡 2 光子/多 photon は理想的になります。
プーマ モデルを適応し、肺植民地化プロセスの多くの側面を研究するように変更できます。この前のヴィヴォアプローチの別の亜種は、・ ヴァン ・ デン ・ Bijgaart と同僚の21によって記述されます。研究用遺伝子ノックダウンまたは抗転移薬活動が 3 × 105 5 x 10 の5から注入された細胞の数を縮小、肺の腫瘍細胞の成長に及ぼす影響を調べることをお勧め介入の効果をマスクすることができますので中に大きなセル innoculum の急増。いくつかの研究は、肺転移の進行4,5,8,22,23,24のドライバーを検討するのにプーマ モデルを使用しています。細胞生理学・遺伝子式8肺微小環境での変化を確認するためには、様々 な蛍光指示薬染料や蛍光レポーター遺伝子をラベル腫瘍細胞に使えます。
プーマのモデルの 1 つの制限には、互換性のある細胞の限られた数が含まれています。この試金と互換性の確立されたセルラインのメンドーサと同僚の3とおりです。成長し、プーマ モデルでその転移傾向を維持し高低転移性骨肉腫細胞株の細胞クローン関連のフォローのペアを発見されている: HOS 細胞、マウスの K7M2 と K12 ・ 143B、MNNG 人間 MG63.3 & mg 63 セルセルです。研究者は、彼らの細胞を B メディアで実行可能に残ることができるかどうか経験的判断する必要があります。考慮するもう一つの制限は、肺組織が体外を維持できる時間の長さを制限です。肺組織は 30 日間、その時間を超えてその細胞成分を保持することが、肺の細胞内成分死ぬことを始めます。腫瘍細胞と肺間質細胞の相互作用を検討して 30 日を超えない。
プーマ モデルは、どのように転移 OS を研究する前例のないメソッドを提供します細胞が肺組織を植民地化します。プーマ モデルの最も印象的な側面は、いくつか低転移 OS 細胞株 (HOS、mg 63、K12) 他特徴とその生体内で表現型がされている25、プーマ モデルで育つことができないという事実から来ています。対照的に、転移性の高い OS クローン関連の細胞 (MNNG、MG63.3、K7M2)25 体内の肺組織を植民地化し、ピューマではモデルより大きい傾向があります。これ生体内で、成長から低転移細胞系統を防ぐため肺微小環境の細胞内外コンポーネントが血流の不足にもかかわらずプーマ モデルでまだ維持されている示唆しています。つまり、プーマ モデルの肺微小環境はまだ低転移 OS 細胞の肺の成長を妨げている「選択圧力」を発揮します。確かに、勉強の高転移性 OS 細胞成長プーマは、転移性表現型4、5の新しい分子ドライバーを識別するに役立っています。また、転移性の高い細胞で当該目標の遺伝的ダウン変調が両方プーマ モデルの転移能力を減少させる示されたと体内5 。候補薬の抗転移研究、プーマの濃度範囲は、肺組織に転移性の副産物を減らすことができますを決定するモデルを使用できますを順番に、できる検証された生体内で。
このモデルの将来のアプリケーションは、OS の転移進行の基本的な生物学に深く掘り下げて調査するために市販の蛍光染料とレポーター遺伝子の茄多を活用すべき。たとえば、2', 7'-dichlorofluorescin アセテートまたは dihydroethidium などの蛍光染料は、プーマ モデルにおける腫瘍細胞の酸化還元状態を評価するために使用できます。蛍光レポーター遺伝子は、オルガネラを勉強したりするシグナル伝達経路は、植民地化プロセス中に OS の転移性の高い細胞で活性化されて決定するプロモーター活性を評価に使用できます。このようなアプローチは、治療薬が肺の成長している腫瘍細胞の活性を有するかどうかを表示する使用できます。LED を搭載した顕微鏡または 2 光子/多光子顕微鏡を使用できますなど、組織に以下の光損傷を生成する蛍光顕微鏡プラットフォーム研究どのように転移 OS 細胞移行し、肺組織中に侵入します。さらに、蛍光レポーター遺伝子と腫瘍細胞と肺間質細胞間接着の相互作用を監視できます。
要約すると、現在の紙は、メンドーサと同僚の3によって最初に開発、プーマ モデルの実用的な側面をについて説明します。高と低転移 OS 細胞の成長を評価する低倍率、広視野蛍光顕微鏡および高分解能共焦点顕微鏡を使用しての例です。プロトコルのいくつかの重要な手順が記載されています。さらに、利点とプーマ モデルの制限事項を説明しています。肺植民地化過程を研究するプーマ モデルの将来のアプリケーションは提唱されているが、このモデルが、骨肉腫の研究コミュニティのより広い使用があることが望まれる.
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
博士 Arnulfo メンドーサ プーマ技術のトレーニングを提供者に感謝したいと思います。 さらに、この研究の過程で、顕微鏡の使用を提供するため夫妻チャンド khanna 博士、スーザン ガーフィールド (NCI/NIH) とサム アパリシオ (紀元前がん庁) を確認したいと思います。この研究は、癌研究、小児腫瘍学の支部センター国立歯科衛生研究の学内研究プログラムによって (の一部) に支えられました。M.M.L.、国家機関の健康学内研究員の研修 (15335 賞)、によって支えられた、現在転移研究のジョアン ・ パーカー交わりに支えられています。P.H.S. は、ブリティッシュ コロンビア州がん財団によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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