Summary
Målet med denne artikel er at give en detaljeret beskrivelse af protokollen til pulmonale metastaser assay (PuMA). Denne model giver forskere til at studere metastatisk osteosarkom (OS) cellevækst i lungevæv ved hjælp af en widefield fluorescens eller Konfokal laser-scanning mikroskop.
Abstract
Den pulmonale metastaser assay (PuMA) er en ex vivo lunge eksplantat og lukkede celle kultur system, der tillader forskere til at studere biologi af lunge kolonisering i osteosarkom (OS) ved Fluorescens mikroskopi. Denne artikel giver en detaljeret beskrivelse af protokollen, og diskuterer eksempler på at opnå billeddata på metastatisk vækst ved hjælp af widefield eller Konfokal Fluorescens mikroskopi platforme. Fleksibiliteten i PuMA model tillader forskere til at studere ikke blot væksten af OS celler i lunge mikromiljø, men også til at vurdere virkningerne af anti-metastatisk therapeutics over tid. Konfokal mikroskopi giver mulighed for hidtil uset, høj opløsning billeder af OS celle interaktioner med lunge parenkym. Desuden PuMA model er kombineret med fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende proteiner genetiske journalister, kan forskere studere lunge mikromiljø, cellulært og subcellulært strukturer, genfunktioner og promotor aktivitet i metastatisk OS celler. PuMA model giver et nyt værktøj til osteosarkom forskere til at opdage nye metastase biologi og vurdere aktiviteten af roman anti-metastatisk, målrettede behandlinger.
Introduction
Bedre resultater for pædiatriske patienter med metastatisk osteosarkom (OS) er stadig en kritisk udækket kliniske behov 1. Dette understreger betydningen af at udvikle nye molekylært målrettet behandlingsformer. Konventionelle kemoterapeutika, at målet tumor celle spredning ikke har vist sig for at være effektiv i behandling af metastatisk sygdom, og dermed nye strategier skal målrette metastatisk processen selv 2. Den nuværende artikel diskuterer de praktiske aspekter af en forholdsvis ny type af ex vivo lunge metastase model, pulmonale metastaser assay (PuMA) udviklet af Mendoza og kolleger3, som giver et nyttigt redskab til at opdage nye Molekylær drivere i lunge metastase progression i OS 4,5. Før du fortsætter, men det ville være klogt at kort berøre flere aktuelle modeller af metastaser, og hvordan PuMA model tilbyder flere fordele i forhold til konventionelle in vitro- undersøgelser.
Mest eksperimentelle modeller bruges til at studere metastase består af in vitro- og i vivo systemer, at sammenfatte enten et bestemt trin eller flere trin af den metastatiske kaskade. Disse skridt omfatter: 1) tumor celler migrerer fra den primære tumor, 2) intravasation i nærheden fartøjer (blod eller lymfe) og transit inden for omsætning, 3) arrestere på sekundære site, 4) ekstravasation og overlevelse på den sekundære site, 5) dannelse af micrometastases, og 6) væksten i vaskulariserede metastaser (figur 1). In vitro modeller af metastaser kan omfatte 2-dimensionelle (2D) migration og 3-dimensionelle (3D) Matrigel invasion assays, som gennemgås i detaljer andetsteds 6. For i vivo modeller, de to almindeligt anvendte modelsystemer omfatter: 1) den spontane metastase model er hvor en tumorceller er orthotopically indsprøjtes i en bestemt vævstype til at danne en lokal tumor, der spontant kaster metastaserende celler til fjerne steder; 2) den eksperimentelle metastase model er, hvor tumorceller er sprøjtet ind i blodkar opstrøms af målorgan. For eksempel, en hale vene injektion af tumor celler resultater i udvikling lunge metastaser5,7,8. Andre eksperimentelle metastase modeller omfatter injektion af tumorceller i milt eller mesenteriallymfeknuderne vene, hvilket resulterer i udvikling af lever metastaser9,10. Praktiske overvejelser af disse i vivo modeller er drøftet i detaljer af Welch 11. En anden i vivo model brugt til at studere metastase i pediatric sarkomer er nyre nyre subkapsulær tumor implantation modellen, hvilket resulterer i lokale tumordannelse og spontane metastaser til lungerne 12,13. En mere teknisk krævende teknik som intravital videomicroscopy kan direkte visualisere, i real-time, interaktioner mellem metastatisk kræftceller og microvasculature af en metastatisk websted (dvs. lungerne eller leveren) som beskrevet af MacDonald14 og Entenberg15, eller kræft celle ekstravasation i chorioallantoic membranen som beskrevet af Kim 16.
PuMA-model er en ex vivo, lunge væv eksplantat, lukkede kultur system hvor væksten af fluorescerende tumorceller kan langs observeres via Fluorescens mikroskopi over en periode på en måned (Se figur 2A). Denne model sammenfatter de indledende stadier af lungekræft kolonisering (trin 3 til 5) i den metastatiske kaskade. Nogle store fordele af PuMA model over konventionelle in vitro- modeller er: 1) det giver mulighed for at måle på langs metastatisk kræft cellevækst i en 3D mikromiljø, der bevarer mange funktioner i lunge mikromiljø i vivo 3; 2) puMA gør det muligt for forskeren at vurdere, om en kandidat gen eller stofmisbrug behandling knockdown har anti-metastatisk aktivitet i forbindelse med en 3D lunge mikromiljø; 3) PuMA-modellen er fleksibel med mange typer af Fluorescens mikroskopi platforme (figur 2B) som widefield Fluorescens mikroskopi eller laser-scanning Konfokal mikroskopi, er eksempler på hver vist i figur 2 c & D, henholdsvis. Denne artikel vil diskutere hvordan PuMA model til at opnå imaging tidsseriedata på metastatisk væksten af forbedrede grøn fluorescerende proteiner (eGFP)-udtrykker, menneskelige høj og lav metastatisk osteosarkom celler (MNNG og HOS cellerne, henholdsvis) ved hjælp af lav forstørrelse widefield fluorescens. Eksempler på imaging et fluorescerende farvestof, som etiketter lunge parenkym, og et rødt-fluorescerende proteiner genetiske reporter, som etiketter mitokondrier i OS celler i PuMA model ved hjælp af laser-scanning konfokalmikroskopi drøftes også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller som billeddiagnostiske data blev fremstillet blev udført med godkendelse af Animal Care og brug Udvalget af National Cancer Institute, nationale institutter for sundhed. Alle dyr protokoller drøftet og portrætteret i artiklen video er blevet godkendt af University of British Columbia animalsk omhu udvalget.
1. forberedelse af tumorceller til injektion og materialer til PuMA model
Bemærk: Mængden af løsninger og celler vil være nok til 1 mus. Skalere op som nødvendigt, hvis flere mus er anvendt i undersøgelsen. For medier opskrifter, henvises til tabel 1 og tabel 2.
- Pre varm 5 mL af A-medier i en 15 mL konisk slange i en 37 oC vandbad.
- Smelt 1,2% lavt smeltepunkt Agarosen løsningen (i sterilt vand) ved hjælp af lab mikrobølgeovn.
- Overføre 5 mL af den smeltede Agarosen i en 15 mL konisk slange, og holde varmen i vandbad 37 oC. Sikre den smeltede Agarosen er på 37 oC og væske før lunge oppustning trin.
- Pre chill 30 mL cellekultur grade PBS suppleret med 1 X pen/strep i en isspand.
- I et godt af en 6-godt plade, pre sættetid en gelatine svamp i 1,5 mL af B-medier. Svampen vil være støtte anker lunge skiver.
- Sikre OS celler er ca 70-90% sammenflydende på dagen for proceduren. Brug ikke celler, der er over sammenflydende eller hvis mediet er orange til gult da cellerne er normalt stressede og har formindsket levedygtighed på dette punkt. For osteosarkom cellelinjer, MNNG og HOS, skal 5 x 105 i et volumen på 100 μL bruges til at tilføre den hale vene af 1 mus. Opskalere således hvis flere mus bruges til undersøgelsen.
- Høste de tumorceller ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA (3 mL til en T75 kolbe eller 2 mL i en 10 cm kultur parabol). Når celler begynder at løfte pladen, neutralisere trypsin-EDTA med komplet media. Spin ned celler og skylles en gang med cellekultur grade PBS. Resuspend pellet i 5 mL PBS.
- Udføre en celletal af standard metoder. Det er bedst at gøre mere cellesuspension end hvad er faktisk nødvendig, da tabet af cellesuspension ofte opstår under nålen udarbejde og mislykkedes injektion forsøg.
- Udføre en Trypan-blå udstødelse analysen på en stikprøve af cellesuspension at vurdere levedygtigheden af cellerne. Fortsæt kun hvis cellen Vis 90% levedygtighed eller højere.
- Indsprøjtes 5 x 105 celler i et volumen på 100 μL. For at forberede et overskud af 2 X af dette beløb, 1 x 106 celler spundet ned og genopslemmes på 0,2 mL HBSS.
- Placer cellesuspension i en isspand samtidig med at forberede mus til injektion.
2. hale vene injektion og lunge oppustning
Bemærk: Mængden af løsninger og celler i dette afsnit vil være nok til 1 mus. Skalere op som nødvendigt, hvis flere mus er anvendt i undersøgelsen. En liste over det udstyr, materialer og kirurgiske instrumenter, der anvendes i de følgende trin, der henvises til tabel 3 og tabel 4.
- Varm en kvindelige mus (alder 6-8 uger) under en varme lampe i 5 min for at gøre deres hale vene mere synligt tilsyneladende. For murine K7M2 eller K12 celler, bruge Balb/c mus; MG63.3, MG63, MNNG og HOS menneskeceller, bruge svær kombineret immundefekt mus.
- Sørg for celle suspensionen er ensartet ved forsigtigt ryste røret. Omhyggeligt udarbejde cellesuspension ind i 1 mL sprøjten uden nålen. Cap i sprøjten med en 27 gauge kanyle. Kontrollér nålen facet er på samme side som volumen markeringer på nålen.
- Placere musen i Tilbageholderen, og svaber hale med en alkohol-serviet.
- Fortsætte med at udføre en hale vene injektion og indsprøjtes 100 μL af cellesuspension. 5 min efter injektionen, placere musen i et CO2 kammer og begynde eutanasi standard operating procedure (som kontur af dit dyrs institutionspleje Udvalget). Cervikal dislokation bør ikke anvendes som et middel til dødshjælp, da proceduren vil skade i luftrøret.
- Når musen er euthanized, begynde udarbejdelsen af laminar flow hætte til oppustning af musen lunge med den løsning ved agarosegelelektroforese/A-medier. Inden for laminar flow hood, oprette et arbejdsområde med sterile musemåtten. På denne pad vil du placere din steriliserede instrumenter, IV kateter, IV forlængelse sæt og tyngdekraften perfusion apparater (Se supplerende fig. 1).
- Placere musen i dorsal recumbancy. Med en steril lille saks, omhyggeligt dissekere ud brystbenet at eksponere brysthulen. Passe på ikke punktere lungen, da en Agarosen/A-media løsning vil blive brugt til insufflate i lungerne.
- Når dissekere ud brystbenet, dissekere forbi thorax fjorden på begge sider i luftrøret. Udsætte luftrøret af dissekere væk det omgivende bløde væv.
- Kanyleres luftrør med en 20 gauge IV kateter. Løst binde en kirurgisk knude ved hjælp af steril catgut sutur omkring det kanylerede luftrøret.
- Vedhæfte IV forlængelse sæt fra catheterized luftrøret til 10 mL sprøjte af tyngdekraften perfusion apparater.
- Kombinere pre varmede 37 oC Agarosen (5 mL) og A-medier (5 mL) i en 1:1 blanding. Hæld den flydende Agarosen/A-media løsning i 10 mL sprøjte af tyngdekraften perfusion enhed. Før oppustning af lungerne med Agarosen/A-media løsning, sikre at hele længden af den forlængelse sæt er blevet primet med Agarosen/A-media, dermed virkningsløs utilsigtet oppustning af lunge prøver med luft.
- Fylde lunge Agarosen/A-media løsning indtil lungerne er fuldt insufflated.
- Når lungerne er fuldt insufflated, fjerne kanylen og fast binde off den kirurgiske knude til at forhindre udsivning af agarase/A-media løsning gennem luftrøret.
- Fortsæt til dissekere ud plukke (luftrøret, hjerte og lunge) fra brysthulen. Sørge for at ikke punktere eller beskadige overfladen af lungen.
- Sted plukke (i nogen bestemt retning) i pre kølet 30 mL PBS, suppleret med 1 X pen/strep og tillade Agarosen/A-media til at størkne i 20 min.
- Ved hjælp af fine saks og pincet, skåret små stykker af lunge (3 mm x 1,5 mm), som vist i figur 1A. Mindre lunge udsnit kan nemt afbildning ved hjælp af en 2,5 X mål. Flere udsnit kan skæres pr. eksperimentelle betingelse, typisk 4-10 skiver pr. gruppe.
Bemærk: For hver eksperimentelle gruppe, Placer lunge skiver i en separat brønd (6-godt plade) indeholder et 2 x 2 cm gelatine svamp pre gennemblødt i B-medier. Mængden af medier pr. brønd bør være 1,5 mL. Ændre medierne hver 2-3 dage. For drug undersøgelser er hyppigheden af skiftende medier/drug bruger bestemmes.
3. Widefield fluorescens billeddannelse af lunge skiver og analyse
Bemærk: For widefield Fluorescens er billedbehandling, mindre skiver skæres (3 mm x 1,5 mm x 1 mm) for at passe afsnittet lunge til 1 billede ved hjælp af en 2,5 X mål.
Billede erhvervelse på et widefield fluorescens mikroskop:
- Lunge skiver er typisk afbildet på 0, 3, 7 og 14 dage efter injektion. I det sterile miljø af den biologiske kabinet, omhyggeligt overføre lunge udsnit fra gelatine svampe til en steril 35 mm glas-bund rundt fad. Passe til ising off overskydende væske fra lungerne skive som den overskydende væske vil fungere som et spejl og afspejle fluorescerende lys, der kommer fra tumorceller.
- Arrangere lunge skiver i en lignende måde afbildet i figur 1A. Hver kolonne ville repræsentere en forskellige eksperimentelle tilstand. Passe på tværs-forurener lungerne med pincet. Skyl med 70% ethanol og tørre før håndtering lunge skiver fra en anden eksperimentel musikgruppe.
- Optimere de billeddiagnostiske parametre (dvs. gevinst, offset, eksponering tid, binning) der giver den bedste kontrast mellem de fluorescerende tumorceller og baggrunden lungevæv i kontrolelementet (køretøj ubehandlet) gruppe. Bruge de samme parametre fra kontrolgruppen til at afbilde de eksperimentelle grupper. Gemme som tiff billedformat.
- For en skala reference, skal du tage et digitalt billede af en mikrometer på det samme mål.
- Da lunge auto-fluorescens ændrer sig over tid, skal de billeddiagnostiske parametre justeres til kontrol lungerne hver tænkelig session. De billeddiagnostiske parametre for en session kan ikke nødvendigvis være optimal for efterfølgende imaging sessioner.
Billedanalyse:
Bemærk: De følgende billede behandlingstrin er færdig med ImageJ 1.51h software pakke 17.
- Åbne en billedfil i ImageJ (figur 3A).
- Subtrahere baggrund: processen > fratræk baggrund > rullende kugle radius (start med 50 pixels), uncheck "Lys baggrund" (figur 3B).
- Konverter billedet til 8-bit format: billede > Type > 8 - bit (figur 3 c).
- Indstillet enheder til pixel: billede > Enter "Pixels" enhed af længde, Skriv 1 i "Pixel bredde", "Pixel højde", "Voxel dybde". "Global" afkrydsningsfeltet gælde for efterfølgende billeder.
- Ved hjælp af Polygon markeringsværktøjet, kontur af hele lunge skive og bestemme området (pixel2) i den samlede lunge skive. Denne værdi bruges til at beregne procent tumor byrden af lungen.
- Tærskel billede: Image > Adjust > tærskel > fremhæve "Standard" og "B & W" > Brug skyderen til tærskel billedet, sådan at fleste af tumorcellerne fremhæves præcist. At trykke på "Anvend" vil resultere i et sort-hvidt billede hvor lungerne er helt sort, og de fluorescerende læsioner er hvide (figur 3D). At trykke på "Anvend" en anden gang vil invertere billedet hvor alle fluorescerende strukturer er nu sort figurer (figur 3).
- Kvantitativ bestemmelse af antal og form af læsioner:
Analysere > sæt målinger > tjekke "Område". Uncheck alle andre bokse.
Analysere partikler > størrelse (pixel2): 0-uendeligt repræsenterer rækken figurer, at ImageJ vil optælle. Empirisk bestemme den mindste læsion, der anses for at være en enkelt tumor celle i dag 0 køretøjet billeder. Brug området i denne enkelt tumor celle som den nedre grænse for de resterende billeder i datasættet. For det arbejde, der er fremlagt i dette papir, er 11 pixel2 angivet som den nedre grænse. For det arbejde, der er fremlagt i eksemplet med video, er 24 pixel2 angivet som den nedre grænse. Forlade "Cirkularitet" interval som 0-1. "Vis" kan indstilles til "Intet". Alternativt, hvis "Vis" og "Konturerne" er markeret, genereres en tegning af alle skitserede figurer. Kontrollere "visningsresultater" for et separat vindue af målinger til at affyre oppe. Eventuelt vil at have "Føj til manager" boks kontrolleres gemme alle figurerne kvantificeret en ROI Manager, som kan gemmes til fremtidig reference. Når du trykker på OK, vil en "Resultater" vindue poppe op, der indeholder alle optalte figurer og området målinger (figur 3F). - Kopiere og indsætte data fra vinduet "Resultater" i et regneark. Brug funktionen SUM matematiske i Excel til at opsummere alle områder af metastatisk læsioner til at bestemt lunge skive. For at vurdere den procentvise lunge tumor byrde af lunge skive, dividere summen af arealerne af metastatisk læsioner af det samlede areal af lunge skive. Denne parameter er også kendt som område brøkdel (etA), som er beskrevet yderligere af Underwood 18.
Lunge tumor byrde = summen af metastatisk læsion områder/samlet område af lungen skive - Beregne lunge tumor byrde for resten af afsnittene lunge i kontrolgruppen og de resterende grupper. Afbilde den gennemsnitlige lunge tumor byrde pr. gruppe over 0, 3, 7 og 14 dage. Repræsentant widefield fluorescerende billeder af høj og lav metastatisk menneskelige OS celler vokser i PuMA model på progressive tidspunkter er vist (figur 4A). En linjegraf viser den fold-ændring (normaliseret til dag 0) i procent metastatisk tumor byrde over tid er vist (figur 4B).
4. Konfokal fluorescens billeddannelse af PuMA Model
Bemærk: For Konfokal imaging, behandling af væv er lig den i forrige afsnit bortset fra at større lunge skiver skæres (komplet tværgående sektioner, 1-2 mm tyk) for at muliggøre mere ROIs til afbildning.
Mærkning af lunge parenkym med DAR4M:
- Fordyb lunge skiver i 10 μμM af DAR4M (i HBSS) for 45 min ved 37 ° C. DAR4M etiketter reaktive nitrogen arter i cellerne i lungerne.
- Efter 45 min inkubation, skyl lungen skiver med friske HBSS.
- Sted lunge skive i en 35 mm glas-bund rundt fad, og billedet på Konfokal mikroskop.
- De imaging parametre for eksempel billeder vist i figur 5 er angivet i tabel 5.
- Erhverve en Z-stakken for en region af interesse. Brug den foreslåede Z skive tykkelse for Nyquist prøveudtagning. En repræsentativ film af en 3D-stak viser grønt fluorescerende OS celler i DAR4M-mærket lungevæv tilbydes i film 1 og supplerende Movie 1.
For eksempel Konfokal billeder vist i figur 5, var imaging-session terminal. Hvis langsgående imaging er påkrævet, brug af et 2-foton eller multi photon udstyret Konfokal LSM mikroskop for billeddannelse tilrådes da der er mindre solskader til levende væv19,20.
Imaging mito-RFP udtrykker MG63 celler i PuMA model:
- Udføre PuMA protokol som disposition i trin 1 og 2 med ved hjælp af MG63 celler, der udtrykker mito-RFP konstruktionen.
- Sted lunge skive i en 35 mm glas-bund rundt fad, og billedet på Konfokal mikroskop.
- De imaging parametre for eksempel billeder vist i figur 6 er angivet i tabel 6. En repræsentativ film af en 3D-stak viser grønt fluorescerende OS celler med rødt fluorescerende mitokondrier er fastsat i Movie 2 og supplerende Movie 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lav forstørrelse widefield Fluorescens mikroskopi
For widefield Fluorescens mikroskopi af PuMA lunge skiver, er repræsentative billeder og kvantificering data vist i figur 2 c, og figur 4A og B. De metastatisk tilbøjeligheder til høj og lav metastatisk cellelinjer er visuelt tydeligt over progressive tidspunkter. MNNG celler kan effektivt kolonisere lungevæv, boer HOS celler ikke kan vokse på alle. Billedanalyse, kan kvantitative data rettes henvendelse for at vurdere vækst over tid, som vist på grafen i figur 4B. Erhvervelse på lav forstørrelse (2,5 X) er foretrukket for at fange det hele lunge udsnit i et billede. Denne metode tillader batch billedbehandling af et stort antal PuMA skiver.
Høj forstørrelse Konfokal Fluorescens mikroskopi
For Konfokal mikroskopi af PuMA lunge skiver, er repræsentative billeder vist i figur 5. Enkelte eGFP-udtrykker MG63 celler kan ses i figur 5A i forhold til lunge parenkym, der er mærket af DAR4M fluorescerende farvestof i figur 5B. En flettede billede er vist i figur 5 c, og en zoomet billede af en fluorescerende tumor celle i et fartøj, der er vist i figur 5 d. 3D-film af figur 5 c og 5 D er vist i filmen 1 og supplerende film 1, henholdsvis. Konfokal imaging subcellulært strukturer såsom mitokondrier er vist i figur 6. Cytosole eGFP-udtryk tillader disposition tumorceller i figur 6A, og mitokondrier mærket med RFP er vist i fig. 6B. En flettede billede ses i figur 6 c. 3D-film af figur 6 c er vist i filmen 2 og supplerende Movie 2. Imaging subcellulært strukturer såsom mitokondrier kan kombineres med andre fluorescerende etiketter til at studere organelle biologi i metastatisk OS celler. Når du tilføjer flere etiketter, sikre, at laser linjer og emission filtre er kompatibel med den særlige fluorophore/fluorescerende proteiner af interesse. Undgå imaging fluorophores/fluorescerende proteiner hvis excitation og emission spectra tæt overlapper.
Figur 1 : Diagram illustrerer den metastatiske kaskade. Metastatisk cascade kan opdeles i flere, trafikhastighedsbegrænsning trin. (1) metastatisk tumor celler forlader den primære tumor site og invaderer ind i den lokale parenkym; (2) tumor celler intravasating i blod/lymfe-fartøjer og transit i omsætning; (3) tumor celle anholdelse på den sekundære websted; (4) tumor celle ekstravasation ud fra microvasculature og overlevelse i den sekundære websted; (5) vækst i micrometastases; (6) væksten i vaskulariserede overt metastatisk tumorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Imaging PuMA lunge skiver ved hjælp af widefield fluorescens og konfokal Fluorescens mikroskopi platforme. A eksempel PuMA udsnit er vist i en glas-bund 35 mm parabol. B Konfokal mikroskop udstyr. (C) eksempel lav forstørrelse billede af en PuMA skive med eGFP-udtryk OS celler. Scalebar = 0,5 mm. (D) eksempel Konfokal billede af et underområde af et PuMA skive. Scalebar = 100 μm. (*) Lunge parenkym hedder red af DAR4M (Se inset) og (∇) peger på at udtrykke eGFP MG63 celler. Scalebar = 30 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Behandling af en lav forstørrelse billede af en PuMA skive ved hjælp af ImageJ. (A) originale PuMA billede. B subtraktion af baggrunden. C konvertering til et 8-bit billede. D tærskel billedet at fremhæve fluorescerende tumorceller. (E) inversion af billedet. (F) optælling af diskrete former og kvantificering af figur områder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Lav forstørrelse serie billeder viser væksten af højt og lavt metastatisk menneskelige OS celler i modellen PuMA tidens. (A) serie billeder af meget metastatisk MNNG celler og lav metastatisk HOS celler er vist på 0, 3, 7 og 14 dage efter injektion. MNNG celler er i stand til at vokse bedre i lunge mikromiljø i modsætning til HOS celler. Scalebar = 1 mm. (B) Fold-ændring i procent metastatisk tumor byrde for MNNG og HOS celler over tid er vist som linje grafer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Konfokal mikroskopi af en DAR4M-mærket PuMA lunge skive. Et repræsentativt Konfokal billede af eGFP-udtrykker MG63 celler i PuMA lungevæv mærket med DAR4M. (A) grønne kanal, der viser eGFP-udtrykker MG63 celler (∇). (B) rød kanal, der viser DAR4M farvestoffet bindende reaktive nitrogen arter i Lungeceller parenkym. Farvestoffet fremhæver lunge parenkym (#), og strukturer, der ligner et blodkar (*). Kanten af PuMA lunge afsnit er angivet (↓). (C) fusioneret grønne og røde billede. Scalebar = 100 μm. (D) en zoomede billede af den stiplede hvide boks (fra C) viser en tumor celle i et fartøj. Scalebar = 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Konfokal mikroskopi af mitochondrier i osteosarcoma celler i modellen PuMA. Et repræsentativt Konfokal billede af mitochondrier i eGFP-udtrykker MG63 celler. (A) grønne kanal, der viser eGFP-udtrykker MG63 celler (∇). (B) røde kanal viser RFP lokaliseret til mitokondrier (*). (C) fusioneret grønne og røde billede. Scalebar = 10 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Kultur medier | Opskrift |
| Komplet Media (500mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X Pen/strep løsning (10000U/mL) | |
| •5 mL L-glutamin (200 mM) | |
| A-medier (250mL) | •177.58 mL sterilt vand |
| •50 mL 10 X M-199 medier | |
| •15 mL 7,5% natriumbikarbonat løsning | |
| •2.25 mL 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetat (i sterilt vand) | |
| •5 mL 10 X Pen/strep løsning (10000U/mL) | |
| •50 mL 10mg/ml bovin insulin | |
| B-medier (500ml) | •427.6 mL sterilt vand |
| •50 mL 10 X M-199 medier | |
| •15 mL 7,5% natriumbikarbonat løsning | |
| •2.25 mL 50 mM hydrocortizone | |
| •125 mL 0,4 mg/ml retinol acetat (i sterilt vand) | |
| •5 mL 10 X Pen/strep løsning (10000U/mL) | |
| •50 mL 10mg/ml bovin insulin |
Tabel 1. Opskrifter til komplet Media, A-media, B-medier. Opskrifter til cellekultur og medier for PuMA assay er angivet.
| Celle kultur reagenser | Beskrivelse | Katalog nr. | Virksomheden |
| MNNG-HOS | stærkt metastatisk OS cellelinie | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | dårligt metastatisk OS cellelinie | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | stærkt metastatisk OS cellelinie | NIELSEN | Amy LeBlanc laboratorium (NCI) |
| MG63 | dårligt metastatisk OS cellelinie | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 medier | Base medier for A-medier og B-medier | 11825015 | Thermofisher |
| Destilleret vand (steriliseret) | Komponent A-medier & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-medier | |||
| 7,5% natriumbikarbonat løsning | Komponent A-medier & | 25080094 | Thermofisher |
| B-medier | |||
| Hydrocortizone | Komponent A-medier & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-medier | |||
| Retinol acetat-vand opløseligt | Komponent af A-medier & B-medier | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Penicillin/Streptomycin 10 X koncentreret (10000 U/ml) løsning | Komponent A-medier & | 15140122 | Thermofisher |
| B-media, komplet media | |||
| Kvæg insulin løsning (10mg/ml) | Komponent A-medier & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-medier | |||
| DMEM, høje glukose | Base medier af komplette medier | 11965092 | Thermofisher |
| L-glutamin (200 mM) | Del af komplette medier | 25030081 | Thermofisher |
| Føtal bovint Serum | Del af komplette medier | 16000044 | Thermofisher |
| Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning | Bruges i cellekultur | 14190144 | Thermofisher |
| Hank's Buffered salte løsning, ingen calcium, ingen magnesium, ingen phenol rød | Anvendes til resuspend celle pellet inden injektionen | 14175095 | Thermofisher |
| Trypsin-EDTA (0,25%), fenol rød | Bruges i cellekultur | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Bruges til at mærke lunge parenkym | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Tabel 2. Celle kultur reagenser for A-medierne, B-medier, og komplet media. Komponenter til media opskrifter, reagenser og buffere er opført med katalog nummer og firmanavn.
| Materialer | Beskrivelse | Katalog nr. | Virksomheden |
| Zeiss 710 Konfokal LSM | Opretstående LSM Konfokal mikroskop | NIELSEN | Zeiss |
| Zeiss 780 Konfokal LSM | Inverteret LSM Konfokal mikroskop | NIELSEN | Zeiss |
| SCID mus | NIKKE. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, kvinde, alder 6-8 uger | NIELSEN | Charles River |
| GelFoam | Anvendes som en støtte til lunge væv sektioner | 59-9863 | Harvard apparater |
| SeaPlaque Agarosen | Brugt under oppustning af lungen | 50100 | Lonza |
| 1 ml sprøjte med 27 gauge kanyle | Anvendes til hale vene injektion | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| 10 ml sprøjte | Bruges til oppustning af lungen | 309604 | BD |
| 20 gauge kateter | Brugt under oppustning af lungen | SR-OX2032CA | TERUMO |
| Abbott IV forlængelse sæt (30", sterilt) | Brugt under oppustning af lungen | 8342 | Medisca |
| Alkohol svaberprøver | Til aftørring hale vene før injektion | 326895 | BD |
| Steril kirurgiske handsker | Asceptic aflevering af musen lungerne | Varierer med størrelsen | Fisherscientific |
| 30 cm lineal | Bruges til oppustning af lungen | Hæfteklammer | |
| Stativet for linealen | Bruges til oppustning af lungen | HS29022A | Pipette.com |
| 35 mm glas-bund kultur parabol | Brugt under billeddannelse af lunge skiver | 81158 | Ibidi |
| Absorberende Underpads med vandtæt fugt barriere | Bruges til at line sterile arbejdsområdet i den biologiske hætte | 56617-014 | VWR |
| Tarmstrenge almindelig resorberbare sutur | Bruges til at binde off kanylerede luftrøret | NIELSEN | Braun |
Tabel 3. Materialer til PuMA. Materialeudgiften til PuMA-protokollen er angivet med katalog nummer og firmanavn.
| Materialer | Beskrivelse | Katalog nr. | Virksomheden |
| Micro dissekere saks 3,5" lige skarpe/skarp | For skæring lunge sektioner | RS-5910 | Roboz |
| 4"(10 cm) lang savtakkede lige ekstra delikat 0,5 mm spids | For at manipulere/bedrift lunge sektioner | RS-5132 | Roboz |
| 4"(10 cm) lang savtakket lille kurve 0,8 mm spids | For at manipulere/bedrift lunge sektioner | RS5135 | Roboz |
| Tommelfinger Dressing pincet; Savtakket; Delikat; 4.5" længde; 1,3 mm spids bredde | For generelle dissektion | RS-8120 | Roboz |
| Tommelfinger Dressing pincet 4,5" savtakkede 2,2 mm spids bredde | For generelle dissektion | RS-8100 | Roboz |
| Ekstra fin mikro Dissecting saks 3,5" lige skarpe/Sharp, 20mm klinge | For generelle dissektion | RS-5880 | Roboz |
| Knapp saks; Straight; Sharp-Blunt; 27mm klinge længde; 4" længde | For generelle dissektion | RS-5960 | Roboz |
Tabel 4. Kirurgiske instrumenter for PuMA. Forskellige rustfrit stål instrumenter anvendes i protokollen er angivet med katalog nummer og firmanavn.
| Parametre | 488 laser | 561 laser | |
| mål | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0.3 W (DIC) M27 | ||
| magt | 2% | 2% | |
| Pixel dwell | 1,61 | 1,61 | |
| Gennemsnit | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Master gevinst | 820 | 814 | |
| Digital gevinst | 1 | 0,51 | |
| Digital forskydning | -4.5 | -9.24 | |
| Pinhole | 51 | 57 | |
| Afstemmelige Filter | 496-553 | 570-618 | |
Tabel 5. Parametre for Konfokal billeddannelse af DAR4M-mærket PuMA sektioner. Specifikke billedet parametre anvendes til opnået Konfokal billederne i den aktuelle papir er angivet i tabellen.
| Parametre | 488 laser | 561 laser | |
| mål | Plan-Apochromat 63 x / 1,40 olie DIC M27 | ||
| magt | 2% | 2% | |
| Pixel dwell | 0,6 | 0,6 | |
| Gennemsnit | 2 (linje) | 2 (linje) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Master gevinst | 449 | 390 | |
| Digital gevinst | 1 | 1.23 | |
| Digital forskydning | 0 | 0 | |
| Pinhole | 136 | 136 | |
| Afstemmelige Filter | 493-550 | 566-703 | |
Tabel 6. Parametre for Konfokal billeddannelse af mitokondrier MG63 celler i PuMA sektioner. Specifikke billedet parametre anvendes til opnået Konfokal billederne i den aktuelle papir er angivet i tabellen.
Supplerende figur 1: tyngdekraften perfusion apparatet. Tyngdekraften perfusion apparatet bruges til at insufflate lunge med en flydende Agarosen/A-media løsning på 20 cm af H20 hydrostatisk tryk. Agarosen/A-media løsning er hældes i 10 mL sprøjte, som er fastgjort ved IV forlængelse angivet til kanylerede luftrøret (ikke vist). Venligst klik her for at downloade denne figur.
Movie 1: Rotation af en 3D Konfokal z-stakken billede af eGFP-udtrykker OS celler i en DAR4M-mærket PuMA lunge skive. DAR4M (røde kanal) bruges til at fremhæve lunge parenkym og eGFP-udtrykker MG63 celler også kan ses (grøn kanal). Scalebar = 100 μm. Venligst klik her for at downloade denne Flyt.
Movie 2: Rotation af en 3D Konfokal z-stakken billede af RFP-mærket mitokondrier i eGFP-udtrykker OS celler i modellen PuMA. Subcellulært organeller som mitokondrier er vist mærket med RFP (røde kanal) i eGFP-udtrykker MG63 celler (grønne kanal) i PuMA model. Scalebar = 10 μm. Venligst klik her for at downloade denne Flyt.
Supplerende Movie 1: zoomede 3D film af en metastatisk OS celle i et fartøj i lungen. En eGFP-udtrykker MG63 celle er vist i fartøj inden for lunge mikromiljø. Scalebar = 30 μM. Venligst klik her for at downloade denne Flyt.
Supplerende Movie 2: zoomede 3D film af mitochondrier i en metastatisk OS celle i lungen. Mitokondrier mærket med RFP er vist i MG63 celler i lunge mikromiljø. Scalebar = 5 μM. Venligst klik her for at downloade denne Flyt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Følgende tekniske artiklen beskriver nogle praktiske aspekter af PuMA model i studere lunge kolonisering i OS. Nogle kritiske trin i den protokol, hvor forskere bør tage ekstra pleje omfatter følgende:
en) cannulation af luftrøret. Luftrør kan let beskadiget mens dissekere de omkringliggende muskler og bindevæv. Derudover kan nålen af kateteret nemt skubbes gennem luftrøret. Betale meget opmærksom på hvordan facet af nålen ind i luftrøret ved indsætning af kanylen.
b) punktering eller beskadige overfladen af lungen. Lungen kan nemt punkteret eller beskadiget med dissekere saks samtidig at fjerne brystbenet og udsætter brysthulen. Vær forsigtig, når dissekere ud plukke fra brysthulen. Punktering eller beskadige overfladen af lungen vil medføre, at flydende Agarosen/A-mediet til at sive ud og lungerne vil være deflateret.
c) fjerne overskydende medier fra lunge sektioner mens imaging. Overskydende flydende medier omkring afsnittet lunge kan forårsage en "" spejleffekt når set på under mikroskop. Den overskydende væske kan afspejle fluorescerende lys fra tumorceller derved overdrive fluorescens område i billedet. Fjernelse af overskydende media væske vil forhindre denne artefakt i billedet. Alternativt kan billede artefakt blive fjernet under efterbehandling af billederne.
d) solskader i levende væv. Når du bruger en kviksølv pære eller lasere af en 1-foton mikroskop, Sørg for at begrænse den tid udsættes for lys. Intensitet/power procentdelen af lyskilden kan også reduceres. Overeksponering for lyskilden kan forårsage solskader til lungevæv. Mikroskoper udstyret med lysemitterende dioder (LED) eller 2-foton/multi-photon mikroskoper ville være ideelt, fordi de producerer mindre solskader i længderetningen billeddiagnostiske undersøgelser.
PuMA model kan tilpasses og ændres for at studere mange aspekter af lunge koloniseringen processen. En anden variant af denne ex vivo fremgangsmåde er beskrevet af van den Bijgaart og kolleger 21. For studier tilrådes undersøger virkningerne af genaktivitet knock-down eller anti-metastatisk stof på tumorcellevækst i lunge, skalering tilbage antallet af celler injiceres fra 5 x 105 til 3 x 105 da virkningerne af intervention kan være maskeret under den eksponentielle vækst i en større celle innoculum. Flere undersøgelser har brugt PuMA model til at studere drivere lunge metastatisk progression 4,5,8,22,23,24. Forskellige fluorescerende indikator farvestoffer eller fluorescerende reporter gener kan bruges til at afmærke tumorceller til at fastslå ændringer i celle fysiologi eller gene expression 8 i lunge mikromiljø.
En begrænsning af PuMA model omfatter et begrænset antal kompatible cellelinjer. De etablerede cellelinier kompatible med denne analyse er opført af Mendoza og kolleger 3 . For høj og lav metastatisk osteosarkom cellelinjer, Følg par alsidighed relaterede cellelinjer er blevet fundet at dyrke og vedligeholde deres metastatisk tilbøjelighed i PuMA model: MG63.3 & MG63 menneskeceller, MNNG & 143B og HOS celler, murine K7M2 og K12 celler. Forskere skal empirisk afgøre, hvorvidt deres cellelinjer kan forblive levedygtige i B-medier. En anden begrænsning at overveje er det begrænsede tidsrum lungevæv kan bevares in vitro. Lungevæv kan bevare sin cellulære komponenter for 30 dage, ud over tid og de cellulære komponenter i lungerne begynder at dø. Derfor at undersøge samspillet mellem tumorceller og lunge stromale celler bør ikke overstige 30 dage.
PuMA-modellen giver en hidtil uset metode for at studere hvordan metastatisk OS celler kolonisere lungevæv. Det mest slående aspekt af PuMA model kommer fra det faktum, at flere lavt metastatisk OS cellelinjer (HOS, MG63, K12), hvis i vivo fænotyper er blevet karakteriseret andetsteds 25, ikke kan vokse i PuMA model. Derimod har alsidighed relaterede meget metastatisk OS celler (MNNG, MG63.3, K7M2) en større tilbøjelighed til at kolonisere lunge væv i vivo25 og i PuMA model. Dette tyder på, at de cellulære og ekstracellulære komponenter af lunge mikromiljø der forhindrer lav metastatisk OS cellelinjer fra vokser i vivo, stadig opretholdes i PuMA model trods manglen blodgennemstrømning. Med andre ord, udøver lunge mikromiljø PuMA model stadig en "selektivt pres", der forhindrer lav metastatisk OS celler fra vokser i lungen. Ja, studere høj metastatisk OS celler vokse i PuMA har været nyttige i at identificere nye molekylære førere af metastatisk fænotype 4,5. Derudover genetiske ned-graduering af nævnte mål i stærkt metastaserende celler blev vist at mindske metastatisk kapacitet i begge PuMA-modellen og in vivo 5. For kandidat anti-metastatisk drug undersøgelser, PuMA model kan bruges til at bestemme, hvilke koncentrationsområde kan reducere metastatisk udvækst i lungevæv, som til gengæld kan så være valideret i vivo.
Fremtidige ansøgninger af denne model bør udnytte overfloden af kommercielt tilgængelige fluorescerende farvestoffer og reporter gener for at dykke dybt ind i den grundlæggende biologi bag OS metastase progression. For eksempel, kan fluorescerende farvestoffer som 2 'er, 7' - dichlorofluorescin diacetat eller dihydroethidium bruges til at vurdere redox tumorceller i modellen PuMA. Fluorescerende reporter gener kan bruges til at studere organelle biologi eller vurdere promotor aktivitet for at afgøre, hvilke signaling veje er aktiveret i stærkt metastatisk OS celler under koloniseringen processen. Sådanne metoder kan bruges til at visualisere, om en behandling har aktivitet i tumorceller vokser i lungen. Fluorescerende mikroskopi platforme, der producerer mindre solskader til væv, såsom LED-udstyret mikroskoper eller 2-foton/multiphoton Konfokal mikroskoper, kan bruges studere hvordan metastatisk OS celler vandrer og invadere i hele lungevæv. Derudover kan vedhæftning interaktioner mellem tumorceller og lunge stromale celler overvåges med fluorescerende reporter gener.
For at opsummere, diskuterer det nuværende papir de praktiske aspekter af PuMA model, først udviklet af Mendoza og kolleger 3. Er vist et eksempel på brug lav forstørrelse, widefield Fluorescens mikroskopi og høj opløsning Konfokal mikroskopi til at evaluere vækst af høj og lav metastatisk OS menneskeceller. Flere kritiske trin i protokollen er blevet beskrevet. Derudover er blevet drøftet fordele og begrænsninger af PuMA model. Fremtidige anvendelser af PuMA model til at studere lunge koloniseringen processen er blevet fremsat, og det er håbet, at denne model vil have en bredere anvendelse i forskerkredse osteosarkom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Arnulfo Mendoza der har givet træning i PuMA teknik. Derudover vil vi gerne anerkende Drs. Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH), og Sam Aparicio (BC kræft Agency) for at give brugen af deres mikroskoper i løbet af denne undersøgelse. Denne forskning blev støttet (delvis) af murene forskningsprogrammet af National Institutes of Health, Center for kræftforskning, pædiatrisk onkologi gren. M.M.L. blev støttet af den nationale institutter af murene besøger Fellow sundhedsprogram (award 15335), og er i øjeblikket understøttes af en Joan Parker Fellowship i metastase forskning. P.H.S. understøttes af British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S.
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
