Summary
والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
Abstract
فحص الرئة ورم خبيث (PuMA) هو نظام الثقافة الخلية المغلقة تسمح للباحثين لدراسة بيولوجيا الاستعمار الرئة في أوستيوساركوما (نظام التشغيل) بالفحص المجهري الأسفار و السابقين فيفو اكسبلانت الرئة. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً للبروتوكول، ويناقش أمثلة للحصول على بيانات الصورة في النمو المنتشر باستخدام ويديفيلد أو منصات مجهرية الأسفار [كنفوكل]. مرونة طراز بوما يسمح للباحثين لدراسة ليس فقط نمو الخلايا OS في المكروية الرئة، ولكن أيضا تقييم آثار العلاجات المضادة المنتشر على مر الزمن. مجهرية [كنفوكل] يسمح للتصوير لم يسبق لها مثيل، والاستبانة تفاعلات الخلية OS مع حمة الرئة. وعلاوة على ذلك، عندما طراز بوما يقترن بالأصباغ الفلورية أو الصحفيين الجينية بروتين فلوري، يمكن دراسة الباحثين المكروية الرئة والهياكل الخلوية وسوبسيلولار، ووظيفة الجينات ونشاط المروج في الخلايا المنتشر من نظام التشغيل. يوفر طراز بوما أداة جديدة للباحثين osteosarcoma اكتشاف جديد ورم خبيث البيولوجيا وتقييم نشاط رواية العلاجات المضادة المنتشر، مستهدفة.
Introduction
لا يزال تحسين النتائج للأطفال المرضى مع osteosarcoma المنتشر (OS) حرجة غير الملباة سريرية 1. وهذا يؤكد أهمية تطوير علاجات جديدة تستهدف جزيئيا. يجب أن تستهدف تشريعات التقليدية أن انتشار الخلايا السرطانية الهدف لم يثبت أن تكون فعالة في علاج المرض المنتشر، وهكذا رواية استراتيجيات عملية المنتشر نفسه 2. المادة الحالية تتناول الجوانب العملية لنوع جديد نسبيا من السابقين فيفو الرئة ورم خبيث النموذجي، مقايسة خبيث الرئوية (PuMA) وضعتها ميندوزا والزملاء3، الذي يوفر أداة مفيدة في اكتشاف جديد الجزيئية من السائقين في الرئة ورم خبيث تطور في نظام التشغيل 4،5. قبل المتابعة، ومع ذلك، فإنه سيكون من الحكمة أن أتطرق بإيجاز إلى العديد من النماذج الحالية لورم خبيث، وكيف طراز بوما يوفر العديد من المزايا على مدى التقليدية في المختبر فحوصات.
النماذج التجريبية الأكثر المستخدمة لدراسة ورم خبيث تتألف من نظم في المختبر و في فيفو أن الخص خطوة معينة أو عدة خطوات لتتالي المنتشر. وتشمل هذه الخطوات: 1) ورم الخلايا المهاجرة بعيداً عن الورم الرئيسي، 2) إينترافاسيشن إلى السفن القريبة (الدم أو اللمفاوية) والعبور داخل الدورة الدموية، 3) إلقاء القبض على الموقع الثانوي، 4) التسرب والبقاء على قيد الحياة في موقع ثانوي، 5) تشكيل ميكروميتاستاسيس، و 6) النمو إلى الانبثاث فاسكولاريزيد (الشكل 1). يمكن أن تتضمن نماذج في المختبر من ورم خبيث ثنائي الأبعاد (2D) الهجرة وثلاثي الأبعاد (3D) فحوصات غزو ماتريجيل التي تستعرض بالتفصيل في أماكن أخرى 6. للنماذج في فيفو ، نظامان النموذجية المستخدمة عادة تشمل: 1) هو نموذج خبيث عفوية أورثوتوبيكالي حقن نوع أنسجة محددة لتشكيل ورم محلي الذي يلقي تلقائياً الخلايا المنتشر فيها خلايا السرطانية إلى مواقع بعيدة؛ 2) نموذج تجريبي خبيث حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الأوعية الدموية المنبع للجهاز الهدف. على سبيل المثال، ذيل حقن الوريد لورم الخلايا النتائج في التنمية الرئة الانبثاث5،،من78. وتشمل نماذج خبيث تجريبية أخرى حقن الخلايا السرطانية في الطحال أو الوريد المساريقي العلوي الذي يؤدي إلى تنمية الانبثاث الكبد9،10. -ناقش بالتفصيل الاعتبارات العملية لهذه النماذج في فيفو ولش 11. في فيفو نموذج آخر يستخدم لدراسة ورم خبيث في طب الأطفال الطويلا هو نموذج غرس الورم اختلال الكلي الكلوي مما يؤدي إلى تشكيل الورم المحلية وورم خبيث عفوية إلى 12،الرئتين13. تصور تقنية أكثر من الناحية التقنية شاقة مثل فيديوميكروسكوبي إينترافيتال يمكن مباشرة، في الوقت الحقيقي، التفاعلات بين خلايا السرطان المنتشر وميكروفاسكولاتوري من موقع المنتشر (أي. الرئة أو الكبد) كما وصفها ماكدونالد14 وانتينبيرج15، أو سرطان الخلية التسرب في غشاء تشوريوالانتويك كما وصفت كيم 16.
طراز بوما هو السابقين فيفو، explant أنسجة الرئة، ونظام الثقافة المغلقة حيث نمو الخلايا السرطانية الفلورسنت طوليا يلاحظ عبر الفحص المجهري الأسفار على مدى فترة شهر (انظر الشكل 2 أ). ويجمل هذا النموذج في المراحل الأولى من الاستعمار الرئة (الخطوات من 3 إلى 5) في تتالي المنتشر. بعض المزايا الرئيسية من طراز بوما على النماذج التقليدية في المختبر : 1) أنه يتيح فرصة لقياس نمو الخلايا السرطان المنتشر في المكروية 3D الذي يحتفظ بالعديد من ميزات المكروية الرئة طوليا في فيفو 3؛ 2) من طراز بوما يسمح الباحث لتقييم ما إذا كان ضربة قاضية لعلاج الجينات أو المخدرات مرشح النشاط المضادة المنتشر في سياق المكروية 3D الرئة؛ 3) من طراز بوما يتسم بالمرونة مع أنواع عديدة من الأسفار منصات مجهرية (الشكل 2) مثل ويديفيلد fluorescence مجهرية أو ليزر المسح المجهري [كنفوكل]، وترد أمثلة لكل في الشكل 2 & د، على التوالي. وسوف تناقش هذه المقالة كيفية استخدام طراز بوما للحصول على بيانات التصوير الطولي على النمو المنتشر من البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-إذ يعرب، عن الخلايا البشرية osteosarcoma المنتشر العالية والمنخفضة (مننج ويخدم الخلايا، على التوالي) باستخدام الأسفار ويديفيلد تضخم منخفض. وتناقش أيضا أمثلة من التصوير صبغة فلورسنت التي تسميات حمة الرئة، وبروتين الأحمر نيون الخلايا الوراثية المراسل الذي تسميات الميتوكوندريا في نظام التشغيل في طراز بوما باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع البروتوكولات الحيوانية التي تم الحصول على بيانات التصوير بالموافقة على "رعاية الحيوان" و "استخدام اللجنة" للمعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة. كافة البروتوكولات الحيوان ناقش وصورت في المقالة الفيديو أقرتها اللجنة الرعاية الحيوانية في جامعة كولومبيا البريطانية.
1. إعداد الخلايا السرطانية للحقن والمواد الخاصة بنموذج من طراز بوما
ملاحظة: الكمية من الحلول والخلايا ستكون كافية للماوس 1. مقياس حسب الاقتضاء إذا استخدمت الفئران أكثر في الدراسة. لوصفات وسائل الإعلام، أرجع إلى الجدول 1 و الجدول 2.
- قبل دافئ مل 5 ألف-الإعلام في أنبوب مخروطي 15 مل في حمام مائي 37 سج.
- تذوب 1.2% انخفاض ذوبان [اغروس] الحل (في الماء المعقم) استخدام مختبر الموجات الدقيقة.
- نقل 5 مل من [اغروس] المنصهر في أنبوب مخروطي 15 مل، والحفاظ على الدفء في حمام مائي 37 سج. ضمان [اغروس] ذاب في 37 سج والسائل قبل الخطوة إينسوفلاتيون الرئة.
- قبل تشيل 30 مل من خلية ثقافة الصف تستكمل مع X 1 القلم/بكتيريا في دلو الجليد برنامج تلفزيوني.
- في بئر واحدة للوحة 6، حسنا، قبل نقع اسفنجة جيلاتين 1.5 مل ب-وسائل الإعلام. وسيكون الأسفنج الارتساء الدعم للشرائح الرئة.
- تأمين الخلايا نظام التشغيل هي حوالي 70-90% المتلاقية في اليوم من هذا الإجراء. لا تستخدم الخلايا روافد المفرط، أو إذا كانت وسائل الإعلام هو اللون البرتقالي الأصفر منذ عادة يتم التشديد على الخلايا وتقلصت قدرة البقاء في هذه المرحلة. لخطوط الخلايا osteosarcoma، مننج، ويخدم، سيتم استخدام 5 × 105 في حجم 100 ميكروليتر لحقن الوريد ذيل الماوس 1. الراقي وبناء على ذلك إذا تم استخدام أكثر من الفئران للدراسة.
- حصاد الخلايا السرطانية باستخدام 0.25% التربسين-يدتا (3 مل لقارورة T75 أو 2 مل في صحن ثقافة 10 سم). عندما بدأت خلايا رفع قبالة اللوحة، تحييد التربسين-يدتا مع وسائل الإعلام كاملة. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وشطف مرة واحدة مع خلية ثقافة الصف PBS. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إجراء عد خلية بالأساليب القياسية. فمن الأفضل لجعل تعليق خلية أكثر من ما هو مطلوب فعلا منذ خسارة تعليق خلية غالباً ما يحدث أثناء رسم الإبرة وفشل محاولات الحقن.
- القيام "مقايسة الاستبعاد" تريبان الأزرق على عينة من تعليق خلية لتقييم صلاحية الخلايا. المضي قدما فقط إذا كانت الخلية إظهار الجدوى 90 في المائة أو أعلى.
- ضخ 5 × 105 خلايا في حجم 100 ميكروليتر. ينبغي أن يعد فائض 2 X من هذا المبلغ، نسج أسفل 1 × 106 خلايا وحراكه في 0.2 مل حبس.
- وضع تعليق خلية في دلو الجليد حين إعداد الفئران لحقن.
2-ذيل حقن الوريد والرئة إينسوفليشن
ملاحظة: الكمية من الحلول والخلايا الموجودة في هذا المقطع سيكون كافياً للماوس 1. مقياس حسب الاقتضاء إذا استخدمت الفئران أكثر في الدراسة. للحصول على قائمة المعدات والمواد والأدوات الجراحية المستخدمة في الخطوات التالية، أرجع إلى الجدول 3 و الجدول 4.
- الحارة ماوس الإناث (سن 6-8 أسابيع) تحت مصباح تدفئة لمدة 5 دقائق كي الذيل الوريد ما يبدو أكثر وضوحاً. للخلايا K7M2 أو K12 مورين، استخدام الفئران بالب/ج؛ للخلايا MG63.3، MG63، مننج، ويخدم البشرية، استخدام الفئران المناعة المشتركة الشديد.
- تأكد من تعليق خلية موحد بالهز الأنبوب بلطف. بعناية بوضع تعليق خلية في محقن 1 مل دون الإبرة. كاب المحاقن مع 27 قياس الإبرة. تأكد من وجود النتوء إبرة على نفس الجانب كعلامات وحدة التخزين على الإبرة.
- ضع الماوس في ريسترينير، ومسحه الذيل مع مسح الكحول.
- الشروع في القيام حقن الوريد ذيل وحقن 100 ميكروليتر من تعليق خلية. ضع الماوس في دائرة2 CO 5 دقائق بعد الحقن، وتبدأ الإجراءات التشغيلية الموحدة القتل الرحيم (كالمخطط الخاص بك لجنة رعاية الحيوان المؤسسية). التفكك عنق الرحم ينبغي أن لا تستعمل كوسيلة للقتل الرحيم منذ الإجراء سيضر القصبة الهوائية.
- حالما يتم euthanized الماوس، البدء في إعداد هود الاندفاق الصفحي إينسوفليشن في الرئة الماوس مع الحل [اغروس]/A--وسائل الإعلام. داخل غطاء الاندفاق الصفحي، قم بإعداد مساحة عمل مع لوحة العقيمة. على هذه اللوحة سوف تضع أدوات معقمة والقسطرة رابعا، رابعا تمديد تعيين، وجهاز نضح الجاذبية (انظر تكميلية الشكل 1).
- ضع الماوس في ريكومبانسي الظهرية. مع مقص صغير عقيمة، بعناية تشريح القص لفضح تجويف الصدر. الحرص على عدم ثقب في الرئة حيث سيتم استخدام حلاً [اغروس]/A-وسائط الإعلام إينسوفلاتي في الرئة.
- عند تشريح خارج القص، تشريح الماضي مدخل الصدر على جانبي القصبة الهوائية. كشف القصبة الهوائية بتشريح الأنسجة اللينة المحيطة بها بعيداً.
- كانولاتي القصبة الهوائية مع قسطرة قياس 20 رابعا. فضفاضة قرانهما جراحة استخدام خياطة الخيوط العقيمة حول القصبة الهوائية مقني.
- إرفاق ملحق الرابع مجموعة من القصبة الهوائية كاثيتيريزيد إلى حقنه 10 مل جهاز نضح الجاذبية.
- الجمع بين حرارة قبل 37 سج [اغروس] (5 مل) وألف-وسائط الإعلام (5 مل) في خليط 1:1. صب السائل الحل [اغروس]/A-وسائط الإعلام في حقنه 10 مل من الجهاز نضح الجاذبية. قبل إينسوفليشن الرئتين مع الحل [اغروس]/A-وسائط الإعلام، التأكد من أن طول تمديد تعيين قد تم جاهزة مع [اغروس]/A-وسائط الإعلام، مما يلغي إينسوفليشن غير مقصود من عينات الرئة بالهواء.
- ملء الرئة الحل [اغروس]/A--وسائل الإعلام حتى الرئة هو إينسوفلاتيد تماما.
- مرة واحدة هو إينسوفلاتيد الرئة تماما، إزالة القنية والتعادل بشدة إيقاف عقده العمليات الجراحية لمنع تسرب الحل أجاراسي/A--وسائل الإعلام من خلال القصبة الهوائية.
- الشروع في تشريح من نتف (القصبة الهوائية والقلب والرئة) من تجويف الصدر. الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح الرئة.
- مكان نتف (في لا اتجاه معين) في 30 مل مبردة مسبقاً لبرنامج تلفزيوني وتستكمل مع القلم X 1/بكتيريا، والسماح [اغروس]/A-وسائط الإعلام على ترسيخ لمدة 20 دقيقة.
- باستخدام مقص جيد وملاقط، قص القطع الصغيرة في الرئة (3 مم × 1.5 مم) كما هو مبين في الشكل 1 ألف. يمكن تصويرها أصغر الرئة الشرائح بسهولة استخدام هدفا X 2.5. ويمكن خفض شرائح متعددة كل حالة تجريبية، عادة 4-10 شرائح كل مجموعة.
ملاحظة: لكل مجموعة تجريبية، وضع شرائح الرئة في بئر منفصلة (6-جيدا لوحة) التي تحتوي على اسفنجة جيلاتين 2 × 2 سم قبل غارقة في وسائل الإعلام ب. يجب أن تكون كمية وسائل الإعلام كل بئر 1.5 مل. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. دراسات المخدرات، هو تواتر تغيير الوسائط/الدواء المستخدم تحديد.
3-ويديفيلد Fluorescence تصوير شرائح الرئة والتحليل
ملاحظة: للأسفار ويديفيلد التصوير، أصغر شرائح يتم قطع (3 مم × 1.5 مم × 1 مم) كي تناسب الصورة 1 باستخدام هدفا X 2.5 المقطع الرئة.
الحصول على الصور في مجهر الأسفار ويديفيلد:
- عادة يتم تصويرها شرائح الرئة في 0, 3 و 7 و 14 يوما بعد انتهاء الحقن. في بيئة معقمة لمجلس الوزراء البيولوجية، بعناية نقل الشرائح الرئة من الجيلاتين جولة الأسفنج لزجاج معقمة 35 مم-قاع الطبق. العناية بالدأب قبالة السوائل الزائدة من شريحة الرئة كما سيكون بمثابة مرآة السوائل الزائدة وتعكس ضوء فلورسنت قادمة من الخلايا السرطانية.
- ترتيب الشرائح الرئة بنفس الطريقة المبينة في الشكل 1A. ويمثل كل عمود شرط تجريبية مختلفة. رعاية لا الصليب-تلويث الرئتين مع الملقط. شطف مع الإيثانول 70% والجافة قبل التعامل مع شرائح الرئة من مجموعة تجريبية أخرى.
- تحسين المعلمات التصوير (ie. مكسب، الإزاحة، التعرض الوقت، binning) التي توفر أفضل التباين بين الخلايا السرطانية الفلورسنت وأنسجة الرئة الخلفية في عنصر التحكم (مركبة دون علاج) مجموعة. استخدام نفس المعلمات من السيطرة على المجموعة في صورة مجموعات تجريبية. حفظ كتنسيق صورة tiff.
- لمرجع نطاق، التقاط صورة رقمية ميكرومتر في نفس الهدف.
- منذ الرئة السيارات-الأسفار التغييرات على مر الزمن، يجب تعديل المعلمات التصوير إلى الرئتين مراقبة كل دورة التصوير. المعلمات التصوير لدورة واحدة قد لا بالضرورة تكون الأمثل لدورات التصوير اللاحقة.
تحليل الصورة:
ملاحظة: تتم خطوات المعالجة الصورة التالية مع إيماجيج ح 1.51 برنامج حزمة 17.
- فتح ملف صورة في إيماجيج (الشكل 3A).
- طرح الخلفية: عملية > "خلفية طرح" > المتداول الكرة دائرة نصف قطرها (ابدأ مع 50 بكسل)، قم بإلغاء تحديد "خلفية الضوء" (الشكل 3).
- تحويل الصورة إلى تنسيق 8 بت: الصورة > نوع > 8-بت (الشكل 3).
- تعيين وحدات بكسل: الصورة > Enter "بكسل" في "وحدة طول"، قم بإدخال 1 في "العرض بكسل"، "الارتفاع بكسل"، "عمق فوكسل". خانة "العالمي" لتطبيق على الصور اللاحقة.
- باستخدام أداة التحديد المضلع، مخطط تفصيلي لشكل شريحة الرئة كاملة وتحديد مجال شريحة مجموع الرئة (2من بكسل). سيتم استخدام هذه القيمة لحساب عبء المئة ورم في الرئة.
- الصورة عتبة: الصورة > ضبط > عتبة > تسليط الضوء على "الافتراضي" و "B & W" > استخدام شريط التمرير لعتبة الصورة مثل أن يسلط الضوء على معظم الخلايا السرطانية بدقة. الضغط على "تطبيق" سيؤدي إلى صورة أبيض وأسود فيها الرئة كل شيء أسود، وآفات الفلورسنت الأبيض (3D الشكل). الضغط على "تطبيق" لمرة ثانية سيتم عكس الصورة فيها جميع الهياكل الفلورسنت الآن الأشكال السوداء (3E الشكل).
- التحديد الكمي لعدد وشكل آفات:
تحليل > تعيين قياسات > التحقق من "المنطقة". قم بإلغاء تحديد كافة خانات أخرى.
تحليل الجزيئات > الحجم (بكسل2): 0-اللانهاية تمثل مجموعة الأشكال التي سوف تعداد إيماجيج. تحديد أصغر الآفة التي تعتبر خلية ورم وحيد في صور المركبات اليوم 0 تجريبيا. استخدام مجال هذه الخلية ورم واحد كحد أدنى للصور المتبقية في مجموعة البيانات. للعمل المعروضة في هذه الورقة، يتم تعيين 11 بكسل2 كحد أدنى. للعمل الذي عرضه في المثال الفيديو، يتم تعيين 24 بكسل2 كحد أدنى. ترك "تدوير" النطاق 0-1. يمكن تعيين "إظهار" "لا شيء". وبدلاً من ذلك، إذا تم تحديد "إظهار" و "الخطوط"، يتم إنشاء رسم من كافة الأشكال المحددة. تحقق من وجود "عرض النتائج" نافذة منفصلة للقياسات يطفو على السطح. بشكل اختياري، بعد المربع "إضافة إلى مدير" محدداً سيوفر جميع الأشكال كمياً إلى مدير العائد على الاستثمار، التي يمكن حفظها للرجوع إليها في المستقبل. بعد الضغط على موافق، سوف يطفو نافذة "نتائج" التي تحتوي على جميع الأشكال المذكورة ومجال القياسات (3F الشكل). - نسخ ولصق البيانات من إطار "نتائج" في جدول بيانات. استخدام الدالة SUM حسابية في Excel لحساب مجموع جميع مجالات الآفات المنتشر لتلك الشريحة الرئة خاصة. لتقييم عبء شريحة الرئة ورم الرئة المئة، تقسيم مجموع مجالات آفات المنتشر بإجمالي مساحة الشريحة الرئة. هذه المعلمة كما هو معروف كسر منطقة (A) الذي يوصف بقنديل 18.
عبء ورم الرئة = مجموع آفة المتنقل المناطق إلى مجموع مساحة شريحة الرئة - حساب عبء ورم الرئة لبقية أقسام الرئة في مجموعة المراقبة والفئات المتبقية. ارسم عبء ورم الرئة متوسط كل مجموعة على 0, 3, 7 و 14 يوما. تظهر الصور ويديفيلد الممثل الفلورية العالية والمنخفضة المنتشر خلايا نظام التشغيل البشرية المتنامية في طراز بوما في نقاط زمنية التدريجي (الشكل 4 أ). ويرد رسم بياني خطي يبين إضعاف-التغيير (تطبيع إلى اليوم 0) في عبء الورم المنتشر في المائة على مر الزمن (الشكل 4 باء).
4-[كنفوكل] Fluorescence تصوير من طراز بوما
ملاحظة: لتصوير [كنفوكل]، تجهيز الأنسجة مشابهة لذلك في القسم السابق فيما عدا أنه يتم قطع أكبر الرئة شرائح (مقاطع عرضية كاملة، 1-2 مم) للسماح لأكثر رويس تصويرها.
وضع العلامات في حمة الرئة مع DAR4M:
- تزج شرائح الرئة في 10 μμM من DAR4M (في حبس) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. DAR4M تسميات أنواع النيتروجين التفاعلي داخل الخلايا الرئة.
- وبعد 45 دقيقة من الحضانة، شطف شرائح الرئة مع حبس جديدة.
- مكان الشريحة الرئة في 35 ملم زجاج السفلي جولة طبق، والصورة على المجهر [كنفوكل].
- يتم سرد المعلمات التصوير للصور مثلاً هو موضح في الشكل 5 في الجدول 5.
- اكتساب Z كدسة لمنطقة الاهتمام. استخدام سمك الشريحة Z المقترح لأخذ العينات نايكست. فيلم ممثل مكدس ثلاثي الأبعاد عرض الخلايا OS الفلورية الخضراء في أنسجة الرئة المسمى DAR4M يرد في 1 الفيلم و تكميلية الفيلم 1.
وكانت الدورة التصوير للصور مثلاً [كنفوكل] هو موضح في الشكل 5، المحطة الطرفية. إذا كان مطلوباً التصوير الطولي، ينصح استخدام 2-فوتون أو فوتون متعدد مجهز [كنفوكل] LSM المجهر للتصوير حيث يوجد أقل د للمعيشة الأنسجة19،20.
وإذ تعرب عن الخلايا MG63 ميتو-طلب تقديم العروض في طراز بوما التصوير:
- تنفيذ البروتوكول بوما كمخطط تفصيلي في الخطوة 1 و 2 باستخدام خلايا MG63 الإعراب عن بناء ميتو-طلب تقديم العروض.
- مكان الشريحة الرئة في 35 ملم زجاج السفلي جولة طبق، والصورة على المجهر [كنفوكل].
- يتم سرد المعلمات التصوير للصور مثلاً هو موضح في الشكل 6 في الجدول 6. فيلم ممثل مكدس ثلاثي الأبعاد عرض الخلايا OS نيون الأخضر مع الأحمر نيون الميتوكوندريا يتم توفيرها في فيلم 2 و تكميلية الفيلم 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تضخم منخفض ويديفيلد fluorescence مجهرية
بالنسبة ويديفيلد fluorescence الفحص المجهري لشرائح الرئة بوما، تبين الصور التمثيلية وتحديد مقدار البيانات في الشكل 2، و الشكل 4A و ب. المزيف المنتشر لخطوط الخليوي المنتشر العالية والمنخفضة تتجلى بصريا عبر النقاط الزمنية تدريجيا. كفاءة الخلايا مننج يمكن استعمار أنسجة الرئة بينما لا تنمو خلايا يخدم على الإطلاق. من تحليل الصور، يمكن الحصول على بيانات كمية لتقييم النمو مع مرور الوقت كما هو موضح في الرسم البياني الشكل 4B. ويفضل الحصول على تكبير منخفضة (2.5 X) بغية التقاط شريحة الرئة كاملة في صورة واحدة. هذا الأسلوب يسمح التصوير دفعة شرائح بوما عدد كبير.
الأسفار [كنفوكل] عالية التكبير المجهري
ل [كنفوكل] مجهرية من شرائح الرئة بوما، تظهر الصور الممثل في الشكل 5. يتبين معربا عن اجفب MG63 خلايا فردية في الشكل 5A فيما يتصل بلحمة الرئة، الذي يسمى بصبغة الفلورسنت DAR4M في الشكل 5B. يتم عرض صورة مدمجة في الشكل 5، وأسرع صورة خلية الورم الفلورسنت في سفينة هو مبين في الشكل 5. الأفلام ثلاثية الأبعاد من الشكل 5 و 5 د ترد في الفيلم 1 و تكميلية الفيلم 1، على التوالي. التصوير [كنفوكل] من هياكل سوبسيلولار مثل الميتوكوندريا ويبين الشكل 6- سيتوسوليك اجفب-التعبير تصاريح الخلايا السرطانية المخطط التفصيلي في الشكل 6A، ويبين الشكل 6Bالميتوكوندريا المسمى مع طلب تقديم العروض. ويعتبر صورة مدمجة في الشكل 6. الأفلام ثلاثية الأبعاد من الشكل 6 ترد في الفيلم 2 و 2 فيلم تكميلية. يمكن الجمع بين التصوير هياكل سوبسيلولار مثل الميتوكوندريا مع التسميات الفلورية الأخرى لدراسة البيولوجيا عضية في الخلايا المنتشر من نظام التشغيل. عند إضافة تسميات أكثر، ضمان أن خطوط الليزر وعوامل الانبعاثات متوافقة مع البروتين فلوروفوري/فلوري معين من الفائدة. تجنب التصوير البروتينات الفلورية fluorophores/الإثارة وأطياف الانبعاث التي تتداخل عن كثب.
الشكل 1 : رسم تخطيطي يوضح تتالي المنتشر. تتالي المنتشر يمكن تقسيمها إلى عدة، خطوات الحد من معدل- (1) ورم المنتشر خلايا ترك الموقع الورم الرئيسي، ويغزو في حمة المحلية؛ (2) ورم الخلايا إينترافاساتينج في الأوعية الدموية/اللمفاوي والعبور داخل الدورة الدموية؛ (3) ورم الخلية القبض في الموقع الثانوي؛ (4) ورم الخلية التسرب خارجاً من ميكروفاسكولاتوري والبقاء على قيد الحياة في الموقع الثانوي؛ (5) النمو في ميكروميتاستاسيس؛ (6) النمو إلى أورام المنتشر العلني فاسكولاريزيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تصوير من طراز بوما الرئة الشرائح باستخدام ويديفيلد الأسفار ومنصات مجهرية الأسفار [كنفوكل]- (A) شرائح من طراز بوما مثال يبين طبق 35 ملم أسفل زجاج. (ب) [كنفوكل] مجهر المعدات. (ج) مثال الصورة منخفضة-التكبير لشريحة من طراز بوما مع خلايا نظام التشغيل اجفب-التعبير. سكليبر = 0.5 مم. (د) مثال الصورة [كنفوكل] من منطقة دون إقليمية شريحة من طراز بوما. سكليبر = 100 ميكرومتر. (*) حمة الرئة يسمى الأحمر من DAR4M (انظر الإطار الداخلي) و (∇) أشر إلى الإعراب عن اجفب الخلايا MG63. سكليبر = 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . معالجة صورة منخفضة-التكبير لشريحة من طراز بوما باستخدام إيماجيج- (A) الصورة بوما الأصلية. (ب) طرح خلفية. (ج) تحويل إلى صورة 8 بت. (د) مستوى العتبة الصورة لتسليط الضوء على الخلايا السرطانية الفلورسنت. (ﻫ (انعكاس للصورة. (و) تعداد الأشكال المنفصلة والتحديد الكمي لمساحات الأشكال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . صور المسلسل منخفضة-التكبير تظهر الخلايا نمو نظام التشغيل البشرية العالية والمنخفضة المنتشر في طراز بوما على مر الزمن- (A) تظهر الصور التسلسلية عالية النقيلي مننج الخلايا والخلايا يخدم المنتشر منخفضة في 0, 3 و 7 و 14 يوما بعد انتهاء الحقن. مننج الخلايا قادرة على النمو في المكروية الرئة على النقيض من الخلايا يخدم أفضل. سكليبر = 1-(ب) إضعاف-التغيير في عبء الورم المنتشر النسبة المئوية للخلايا مننج ويخدم مع مرور الوقت تظهر كخط الرسومات البيانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : [كنفوكل] الفحص المجهري لشريحة الرئة المسمى DAR4M من طراز بوما. صورة [كنفوكل] ممثل للتعبير عن اجفب MG63 الخلايا في أنسجة الرئة بوما المسمى مع DAR4M. (أ) الأخضر قناة عرض التعبير عن اجفب الخلايا MG63 (∇). (ب) الأحمر قناة عرض صبغ DAR4M ملزم للأنواع النيتروجين التفاعلي في خلايا الرئة حمة. الصبغ يبرز حمة الرئة (#)، وهياكل تشبه الأوعية الدموية (*). إلى الحافة من طراز بوما قسم الرئة (↓). (ج) ممزوج الصورة أخضر وأحمر. سكليبر = 100 ميكرومتر. (د) صورة أسرع من مربع أبيض متقطع (من ج) يوضح خلية ورم في سفينة. سكليبر = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : [كنفوكل] مجهرية من الميتوكوندريا في الخلايا osteosarcoma في طراز بوما. صورة [كنفوكل] ممثل من الميتوكوندريا في الخلايا MG63 التعبير عن اجفب. (أ) الأخضر قناة عرض التعبير عن اجفب الخلايا MG63 (∇). (ب) الأحمر قناة عرض طلب تقديم العروض المترجمة إلى الميتوكوندريا (*). (ج) ممزوج الصورة أخضر وأحمر. سكليبر = 10 ميكرومترات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الثقافة الإعلامية | وصفه |
| وسائط كاملة (500 مل) | •440 مل دميم |
| •50 مل FBS | |
| • 5 مل 10 × الحل القلم/بكتيريا (10000U/mL) | |
| • 5 مل لام الجلوتامين (200 ملم) | |
| أ-وسائل الإعلام (250 مل) | •177.58 مل من الماء المعقم |
| مل •50 10 × M-199 وسائل الإعلام | |
| •15 مل 7.5% محلول بيكربونات الصوديوم | |
| مل •2.25 من هيدروكورتيزوني 50 مم | |
| •125 مل 0.4 ملغ/مل خلات الريتينول (في الماء المعقم) | |
| • 5 مل من 10 × الحل القلم/بكتيريا (10000U/mL) | |
| مل •50 10 ملغ/مل الأنسولين البقري | |
| ب-وسائل الإعلام (500 مل) | •427.6 مل من الماء المعقم |
| مل •50 10 × M-199 وسائل الإعلام | |
| •15 مل 7.5% محلول بيكربونات الصوديوم | |
| مل •2.25 من هيدروكورتيزوني 50 مم | |
| •125 مل 0.4 ملغ/مل خلات الريتينول (في الماء المعقم) | |
| • 5 مل من 10 × الحل القلم/بكتيريا (10000U/mL) | |
| مل •50 10 ملغ/مل الأنسولين البقري |
الجدول 1. وصفات لوسائل الإعلام كاملة، أ-وسائل الإعلام، ب-وسائل الإعلام. وصفات للخلية والثقافة ووسائط الإعلام للمقايسة بوما مذكورة.
| خلية ثقافة الكواشف | الوصف | رقم الفهرس | الشركة |
| مننج-هوس | خط خلية نظام التشغيل المنتشر جداً | CRL-1547 | ATCC |
| هوس | خط الخلية OS سيئة المنتشر | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | خط خلية نظام التشغيل المنتشر جداً | N/A | إيمي لوبلان المختبرية (NCI) |
| MG63 | خط الخلية OS سيئة المنتشر | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 وسائل الإعلام | وسائل الإعلام قاعدة لوسائل الإعلام أ وب | 11825015 | ثيرموفيشير |
| ماء مقطر (تعقيم) | المكون من وسائل الإعلام A & | 15230-147 | ثيرموفيشير |
| ب-وسائل الإعلام | |||
| 7.5% من محلول بيكربونات الصوديوم | المكون من وسائل الإعلام A & | 25080094 | ثيرموفيشير |
| ب-وسائل الإعلام | |||
| هيدروكورتيزوني | المكون من وسائل الإعلام A & | H6909 | سيغما--الريش |
| ب-وسائل الإعلام | |||
| الذوبان في الماء خلات الريتينول | مكون من وسائل الإعلام A & ب-وسائط الإعلام | R0635-5 ملغ | سيغما--الريش |
| الحل البنسلين والستربتوميسين/10 × مركزة (10000 U/ml) | المكون من وسائل الإعلام A & | 15140122 | ثيرموفيشير |
| ب-وسائل الإعلام، وسائل الإعلام كاملة | |||
| الحل الأنسولين البقري (10 مغ/مل) | المكون من وسائل الإعلام A & | I0516-5 مل | سيغما--الريش |
| ب-وسائل الإعلام | |||
| دميم، ارتفاع الجلوكوز | قاعدة الوسائط وسائط كاملة | 11965092 | ثيرموفيشير |
| لام-الجلوتامين (200 ملم) | مكون وسائط كاملة | 25030081 | ثيرموفيشير |
| مصل الدم البقري الجنين | مكون وسائط كاملة | 16000044 | ثيرموفيشير |
| فوسفات دولبيكو في مخزنة المالحة | تستخدم في زراعة الخلايا | 14190144 | ثيرموفيشير |
| مخزنة أملاح الحل في هانك، لا الكالسيوم، المغنيسيوم لا، أي أحمر الفينول | المستخدمة في ريسوسبيند بيليه الخلية قبل الحقن | 14175095 | ثيرموفيشير |
| التربسين-يدتا (0.25%)، الفينول الحمراء | تستخدم في زراعة الخلايا | 25200114 | ثيرموفيشير |
| DAR4M | تستخدم لتسمية حمة الرئة | ALX-620-069-M001 | إنزو |
الجدول 2. خلية ثقافة الكواشف A-وسائط الإعلام، ب-وسائط الإعلام، واستكمال وسائل الإعلام. يتم سرد المكونات لوصفات وسائل الإعلام والمواد الكاشفة والمخازن المؤقتة مع اسم الشركة ورقم الكتالوج.
| المواد | الوصف | رقم الفهرس | الشركة |
| LSM زايس 710 [كنفوكل] | مجهر [كنفوكل] LSM تستقيم | N/A | زايس |
| LSM زايس 780 [كنفوكل] | مجهر [كنفوكل] LSM مقلوب | N/A | زايس |
| الفئران مشمولان | إيماءة. CB17-بركدكسسيد/نكركرل، أنثى، عمر 6-8 أسابيع | N/A | نهر تشارلز |
| جيلفوام | تستخدم كدعم لأقسام أنسجة الرئة | 59-9863 | جهاز هارفارد |
| سيبلاك [اغروس] | تستخدم أثناء إينسوفليشن في الرئة | 50100 | Lonza |
| قياس 1 مل المحاقن مع 27 إبرة | تستخدم لحقن الوريد الذيل | فيشيرسسينتيفيك | |
| 14-826-87 | |||
| حقنه 10 مل | تستخدم إينسوفليشن للرئة | 309604 | دينار بحريني |
| قسطرة قياس 20 | تستخدم أثناء إينسوفلاتيون في الرئة | ريال OX2032CA | تيرومو |
| تعيين الملحق "الرابع أبوت" (30 بوصة، ستيريلي) | تستخدم أثناء إينسوفلاتيون في الرئة | 8342 | ميديسكا |
| مسحات الكحول | لمسح ذيل الوريد قبل الحقن | 326895 | دينار بحريني |
| القفازات الجراحية المعقمة | تسليم أسسيبتيك الرئتين الماوس | ويختلف مع الحجم | فيشيرسسينتيفيك |
| مسطرة 30 سم | تستخدم إينسوفليشن للرئة | المواد الغذائية الأساسية | |
| موقف الدعم للمسطرة | تستخدم إينسوفليشن للرئة | HS29022A | Pipette.com |
| طبق الثقافة زجاجية 35 مم | تستخدم أثناء تصوير شرائح الرئة | 81158 | عبدي |
| أونديربادس ماصة مع حاجز الرطوبة للماء | تستخدم لخط منطقة العمل العقيم في قلنسوة البيولوجية | 56617-014 | VWR |
| خياطة الامتصاص كرومي عادي | يستخدم لربط قبالة القصبة الهوائية مقني | N/A | براون |
الجدول 3. مواد بوما. وترد المواد المطلوبة للبروتوكول بوما مع اسم الشركة ورقم الكتالوج.
| المواد | الوصف | رقم الفهرس | الشركة |
| تشريح الصغرى المقص 3.5 بوصة على التوالي شارب/شارب | لقطع أجزاء الرئة | جمهورية صربسكا-5910 | روبوز |
| 4 "(10 سم) طويلة مسننة مباشرة تلميح إضافية الحساس 0.5 مم | لأقسام الرئة التلاعب القابضة | جمهورية صربسكا-5132 | روبوز |
| 4 "(10 سم) منحنى طفيف منذ فترة طويلة مسننة الحافة 0.8 مم | لأقسام الرئة التلاعب القابضة | RS5135 | روبوز |
| الإبهام خلع الملابس ملقط؛ مسنن؛ الحساسة؛ 4.5 "طول؛ عرض تلميح 1.3 مم | للتشريح العام | جمهورية صربسكا-8120 | روبوز |
| الإبهام خلع الملابس ملقط 4.5 "مسنن عرض تلميح 2.2 مم | للتشريح العام | جمهورية صربسكا-8100 | روبوز |
| غرامة إضافية مقص تشريح الصغير 3.5 بوصة مستقيمة حادة/حاد، شفرة 20 مم | للتشريح العام | جمهورية صربسكا-5880 | روبوز |
| مقص ناب؛ على التوالي؛ شارب-بلانت؛ طول شفرة 27 مم؛ 4 "الطول الإجمالي | للتشريح العام | جمهورية صربسكا-5960 | روبوز |
الجدول 4. الأدوات الجراحية بوما. يتم سرد مختلف الفولاذ المقاوم للصدأ الأدوات المستخدمة في البروتوكول مع اسم الشركة ورقم الكتالوج.
| معلمات | الليزر 488 | الليزر 561 | |
| والهدف | زايس ث ن-أتشروبلان 10 ×/0.3 W (DIC) M27 | ||
| الطاقة | 2% | 2% | |
| يسكن بكسل | 1.61 | 1.61 | |
| في المتوسط | 0 | 0 | |
| التكبير/التصغير | 1 | 1 | |
| مكاسب رئيسية | 820 | 814 | |
| اكتساب الرقمية | 1 | 0.51 | |
| الإزاحة الرقمي | -4.5 | -9.24 | |
| الثقب | 51 | 57 | |
| تصفية الانضباطي | 496-553 | 570-618 | |
الجدول 5. معلمات لتصوير [كنفوكل] من فروع بوما المسمى DAR4M- وترد في الجدول معلمات الصورة المحددة المستخدمة للحصول على الصور [كنفوكل] في الورقة الحالية.
| معلمات | الليزر 488 | الليزر 561 | |
| والهدف | الخطة--أبوتشرومات 63 x/1.40 نفط DIC M27 | ||
| الطاقة | 2% | 2% | |
| يسكن بكسل | 0.6 | 0.6 | |
| في المتوسط | 2 (خط) | 2 (خط) | |
| التكبير/التصغير | 2.3 | 2.3 | |
| مكاسب رئيسية | 449 | 390 | |
| اكتساب الرقمية | 1 | 1.23 | |
| الإزاحة الرقمي | 0 | 0 | |
| الثقب | 136 | 136 | |
| تصفية الانضباطي | 493-550 | 566-703 | |
الجدول 6. معلمات لتصوير [كنفوكل] الميتوكوندريا MG63 الخلايا في فروع بوما. وترد في الجدول معلمات الصورة المحددة المستخدمة للحصول على الصور [كنفوكل] في الورقة الحالية.
تكميلية الشكل 1: جهاز نضح الجاذبية. يستخدم جهاز نضح الجاذبية إينسوفلاتي في الرئة مع حلاً [اغروس]/A--وسائل الإعلام سائلة في 20 سم ح20 الضغط الهيدروستاتي. الحل [اغروس]/A-وسائط يسكب في حقنه 10 مل، وهو مرفق بملحق الرابع تعيين إلى القصبة الهوائية مقني (غير معروضة). اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
الفيلم 1: استدارة صورة z [كنفوكل] 3D-المكدس للإعراب عن اجفب OS الخلايا في شريحة الرئة المسمى DAR4M من طراز بوما. DAR4M (قناة الأحمر) يستخدم لتسليط الضوء على حمة الرئة والإعراب عن اجفب الخلايا MG63 يمكن أيضا أن ينظر إليها (قناة الأخضر). سكليبر = 100 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا التحرك-
الفيلم 2: استدارة صورة z [كنفوكل] 3D-مكدس لطلب تقديم العروض المسماة الميتوكوندريا في نظام التشغيل اجفب-الإعراب عن الخلايا في طراز بوما. وترد سوبسيلولار العضيات مثل الميتوكوندريا المسمى مع طلب تقديم العروض (القناة الحمراء) في الخلايا MG63 الإعراب عن اجفب (قناة الأخضر) في طراز بوما. سكليبر = 10 ميكرومترات. اضغط هنا لتحميل هذا التحرك-
تكميلية الفيلم 1: فيلم 3D التكبير خلية نظام التشغيل المنتشر في سفينة في الرئة- خلية MG63 الإعراب عن اجفب يرد في السفينة داخل المكروية الرئة. سكليبر = 30 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا التحرك-
تكميلية الفيلم 2: فيلم 3D التكبير من الميتوكوندريا في خلية OS المنتشر في الرئة- ويبين الخلايا MG63 في المكروية الرئة الميتوكوندريا المسمى مع طلب تقديم العروض. سكليبر = 5 ميكرومترات. اضغط هنا لتحميل هذا التحرك-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المادة التقنية التالية توضح بعض الجوانب العملية من طراز بوما في دراسة الاستعمار الرئة في نظام التشغيل. فيما يلي بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول بحيث أن الباحثين ينبغي أن تأخذ الرعاية الإضافية:
أ) كانوليشن من القصبة الهوائية. القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء تشريح المحيطة العضلات والنسيج الضام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة دفع إبرة القسطرة عن طريق القصبة الهوائية. إيلاء اهتمام وثيق لكيفية الشطب الإبرة يدخل القصبة الهوائية عند إدراج القنية.
ب) ثقب أو إتلاف سطح الرئة. يمكن بسهولة ثقب الرئة أو أضرار بتشريح مقص أثناء إزالة القص وفضح تجويف الصدر. كن حذراً عند تشريح بنتف من تجويف الصدر. ثقب أو إتلاف سطح الرئة سوف يسبب السائل [اغروس]/A-وسائط الإعلام تسرب وسوف قلصت في الرئة.
ج) قم بإزالة الوسائط الزائدة من أقسام الرئة أثناء التصوير. وسائط السائل الزائدة المحيطة بالقسم الرئة يمكن أن يسبب تأثير "مرآة" عندما ينظر إليها تحت المجهر. السائل الزائد يمكن أن تعكس ضوء الفلورسنت من الخلايا السرطانية وبالتالي المبالغة في مجال الأسفار في الصورة. سيتم منع إزالة السوائل الزائدة من وسائط الإعلام هذه القطع الأثرية في الصورة. وبدلاً من ذلك، يمكن إزالة قطعة أثرية الصورة أثناء تجهيز الصور.
د) د في الأنسجة الحية. عند استخدام لمبة الزئبق أو أشعة الليزر من المجهر 1-فوتون، يجب التأكد من يحدد الوقت الذي يتعرض للضوء. يمكن أيضا أن يخفض نسبة الكثافة/الطاقة من مصدر الضوء. يمكن أن يسبب التعرض المفرط لمصدر الضوء د لانسجة الرئة. مجاهر مزودة بالضوء التي تنبعث منها الثنائيات (الصمام) أو المجاهر 2-فوتون/متعددة-فوتون سيكون أمرا مثاليا لأنها تنتج أقل د خلال دراسات التصوير الطولي.
طراز بوما يمكن تكييفها وتعديلها لدراسة جوانب كثيرة من عملية استعمار الرئة. متغير آخر لهذا النهج السابقين فيفو تصفها فإن دن بيججارت والزملاء 21. للدراسات بدراسة آثار النشاط تدق لأسفل أو المنتشر لمكافحة المخدرات الجينات في نمو الخلايا السرطانية في الرئة، تقليص عدد الخلايا حقن من 5 × 105 إلى 3 × 105 ينصح منذ آثار التدخل يمكن أن يكون مقنعا وخلال النمو الأسى لتربة خلية أكبر. واستخدمت عدة دراسات طراز بوما لدراسة القوى المحركة لتطور المنتشر الرئة 4،8،5،22،،من2324. يمكن استخدام مختلف الأصباغ الفلورية المؤشر أو الجينات مراسل الفلورية إلى تسمية الخلايا السرطانية للتحقق من التغييرات في خلية علم وظائف الأعضاء أو الجينات التعبير 8 في المكروية الرئة.
يتضمن القيد واحد من طراز بوما على عدد محدود من خطوط الخلايا متوافق. يتم سرد خطوط الخلايا المحددة متوافقة مع هذا التحليل ميندوزا والزملاء 3 . لخطوط الخلايا osteosarcoma العالية والمنخفضة المنتشر، تم العثور على أزواج متابعة خطوط الخلايا ذات الصلة كلونالي على النمو والحفاظ على ميلها المنتشر في طراز بوما: الخلايا البشرية MG63.3 & MG63 مننج & 143B ويخدم الخلايا، مورين K7M2 و K12 الخلايا. يجب تحديد الباحثين تجريبيا أم لا يمكن البقاء على خطوط الخلية في وسائل الإعلام ب. قيد آخر للنظر هو طول محدودة من الوقت يمكن المحافظة على أنسجة الرئة في المختبر. يمكن الاحتفاظ بأنسجة الرئة مكوناته الخلوية لمدة 30 يوما، بعد ذلك الوقت والمكونات الخلوية للرئة تبدأ تموت. دراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية وخلايا الرئة stromal ولذلك ينبغي أن لا تتجاوز ثلاثين يوما.
طراز بوما يوفر طريقة غير مسبوقة لدراسة نظام التشغيل كيف المنتشر استعمار خلايا أنسجة الرئة. الجانب الأكثر إثارة للدهشة من طراز بوما يأتي من حقيقة أن عدة منخفضة المنتشر OS خطوط الخلايا (هوس، MG63، K12)، التي تعمل في فيفو قد اتسمت في أماكن أخرى 25، لا يمكن أن تنمو في طراز بوما. على النقيض من ذلك، قد الخلايا OS المنتشر العالية المرتبطة كلونالي (مننج، MG63.3، K7M2) ميل أكبر لاستعمار أنسجة الرئة في فيفو25 وفي طراز بوما النموذجية. وهذا يوحي بالاحتفاظ بمكونات الخلوية وخارج الخلية المكروية الرئة التي تحول دون زراعة في فيفو، منخفضة خطوط الخلايا المنتشر في نظام التشغيل لا يزال في طراز بوما على الرغم من عدم وجود تدفق الدم. وبعبارة أخرى، المكروية الرئة من طراز بوما لا تزال ضغطاً "تحديد" يمنع انخفاض خلايا نظام التشغيل المنتشر من تزايد في الرئة. في الواقع، دراسة عالية النقيلي OS خلايا تنمو في بوما كانت مفيدة في تحديد برامج تشغيل جزيئية جديدة من النمط الظاهري المنتشر 4،5. وعلاوة على ذلك، كان سيظهر أسفل-التحوير الوراثي الأهداف المذكورة في الخلايا عالية المنتشر إلى التقليل من قدرة المنتشر في كل طراز بوما و المجراة في 5- مرشح المخدرات المنتشر المضادة الدراسات، بوما يمكن استخدام النموذج لتحديد نطاق التركيز التي يمكن أن تقلل من ثمرة المنتشر في أنسجة الرئة، الذي بدوره، ثم يمكن تم التحقق من صحتها في فيفو.
التطبيقات المستقبلية لهذا النموذج ينبغي استغلال عدد كبير من الأصباغ الفلورية المتاحة تجارياً والجينات مراسل للخوض العميق في البيولوجيا الأساسية لتطور ورم خبيث في نظام التشغيل. على سبيل المثال، يمكن استخدام الأصباغ الفلورية مثل 2 '7'-ديتشلوروفلوريسسين اسيتات أو ديهيدروثيديوم لتقييم حالة الأكسدة والاختزال في الخلايا السرطانية في طراز بوما. يمكن استخدام الجينات مراسل الفلورسنت لدراسة البيولوجيا عضية أو تقييم نشاط مروج لتحديد مسارات الإشارات التي يتم تنشيطها في الخلايا عالية المنتشر من نظام التشغيل أثناء عملية الاستعمار. يمكن استخدام هذا النهج لتصور ما إذا كان علاج من تعاطي المخدرات وقد النشاط في الخلايا السرطانية التي تنمو في الرئة. دراسة منصات مجهر فلوري التي تنتج أقل د للأنسجة، مثل المجاهر مجهزة بالصمام أو مجاهر [كنفوكل] 2-فوتون/مولتيفوتون، يمكن أن تستخدم نظام التشغيل المنتشر كيف تهاجر الخلايا وغزو في جميع أنحاء أنسجة الرئة. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد التفاعلات الالتصاق بين الخلايا السرطانية وخلايا الرئة stromal مع الجينات مراسل الفلورسنت.
وتناقش الورقة الحالية لتلخيص، الجوانب العملية من طراز بوما، تضعها ميندوزا والزملاء 3لأول مرة. يتم عرض مثال من استخدام التكبير المنخفض، ويديفيلد fluorescence مجهرية وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لتقييم نمو الخلايا OS البشرية العالية والمنخفضة المنتشر. وقد وصف العديد من الخطوات الحاسمة للبروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، تم مناقشة مزايا وقيود من طراز بوما. التطبيقات المستقبلية من طراز بوما لدراسة عملية استعمار الرئة قد طرحت، ومن المأمول أن يكون هذا النموذج استخدام على نطاق أوسع في الأوساط البحثية osteosarcoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور أرنولفو مندوزا الذي وفر التدريب في تقنية بوما. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نعترف بيليغوز تشاند خانا، سوزان غارفيلد (NCI/المعاهد الوطنية للصحة)، ووسام أباريسيو (وكالة السرطان قبل الميلاد) لتوفير استخدام مجاهر بها أثناء هذه الدراسة. وأيد "البرنامج البحوث الداخلية" "المعاهد الوطنية للصحة"، مركز "بحوث السرطان"، طب الأورام فرع هذا البحث (جزئيا). M.M.L. أيده "المعاهد من البرنامج الصحي الوطني الداخلية زيارة زميل" (جائزة 15335)، وتدعمها حاليا على "جوان باركر زمالة" في "أبحاث ورم خبيث". P.H.S. معتمد من قبل "مؤسسة مكافحة السرطان في كولومبيا البريطانية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
References
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S.
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
