Summary
L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).
Abstract
L’essai de métastase pulmonaire (PuMA) est une ex vivo explant de poumon et le système de culture de cellules fermées qui permet aux chercheurs d’étudier la biologie de la colonisation de poumon dans l’ostéosarcome (OS) par microscopie à fluorescence. Cet article fournit une description détaillée du protocole et traite des exemples d’obtenir des données d’image sur la croissance métastatique à l’aide de widefield ou plateformes de microscopie confocal fluorescence. La souplesse du modèle PuMA permet des chercheurs d’étudier non seulement la croissance des cellules d’OS dans le microenvironnement de poumon, mais aussi pour évaluer les effets de la thérapeutique anti-métastatique au fil du temps. La microscopie confocale permet l’imagerie haute résolution, sans précédent des interactions cellulaires OS avec le parenchyme pulmonaire. En outre, le modèle PuMA est associé à des colorants fluorescents ou reporters génétique de la protéine fluorescente, les chercheurs peuvent étudier le microenvironnement de poumon, les structures cellulaires et subcellulaires, la fonction du gène et l’activité de promoteur dans les cellules d’OS métastatiques. Le modèle PuMA offre un nouvel outil pour les chercheurs d’ostéosarcome à découvrir la nouvelle biologie de métastase et évaluer l’activité de nouveaux traitements anti-métastatiques et ciblées.
Introduction
Amélioration des résultats pour les patients pédiatriques atteints d’ostéosarcome métastatique (OS) reste encore une critique comblés clinique 1. Cela souligne l’importance de développer des nouvelles thérapies moléculaires ciblées. Des agents chimiothérapeutiques classiques que la prolifération des cellules tumorales cible n’ont pas été prouvées pour être efficace dans le traitement de la maladie métastatique et donc de nouvelles stratégies doivent cibler le processus métastatique lui-même 2. L’actuel article porte sur les aspects pratiques d’un type relativement nouveau de ex vivo le modèle métastase pulmonaire, le dosage de métastase pulmonaire (PuMA) développé par Mendoza et ses collègues3, qui fournit un outil utile pour découvrir de nouveaux conducteurs moléculaires dans la progression de métastases pulmonaires en OS 4,5. Toutefois, avant de poursuivre, il serait prudent d’aborder brièvement plusieurs modèles actuels de métastases et comment le modèle PuMA offre plusieurs avantages sur conventionnelles in vitro tests.
Des modèles plus expérimentaux utilisés pour étudier les métastases comprennent des systèmes in vitro et in vivo de récapitulent une étape spécifique ou plusieurs étapes de la cascade métastatique. Ces étapes incluent : émigrer loin de la tumeur primitive, l’intravasation 2) dans des navires voisins (sanguin ou lymphatique) et transport en commun au sein de la circulation, des cellules de tumeur 1) 3) arrêter au site secondaire, extravasation 4) et la survie du site secondaire, formation de 5) des micrométastases et 6) la croissance des métastases vascularisés (Figure 1). Les modèles in vitro de la métastase peuvent inclure 2 dimensions migration (2D) et 3 Dimensions (3D) analyses d’invasion Matrigel qui sont examinés en détaillent ailleurs 6. Pour les modèles in vivo , les deux systèmes de modèles couramment utilisés comprennent : 1) le modèle de métastase spontanée est où des cellules tumorales sont orthotopically injecté dans un type spécifique de tissu pour former une tumeur locale qui apporte spontanément des cellules métastatiques à des endroits éloignés ; 2) le modèle expérimental de métastase est où les cellules tumorales sont injectés dans le vaisseaux sanguins en amont de l’organe cible. Par exemple, une queue injection dans la veine des résultats de cellules de tumeur dans le développement du poumon métastases5,7,8. Autres modèles expérimentaux métastase comprennent l’injection de cellules tumorales dans la rate ou de la veine mésentérique qui se traduit par le développement des métastases hépatiques9,10. Des considérations pratiques de ces modèles in vivo sont examinées en détail par Welch 11. Un autre modèle in vivo utilisé pour étudier des métastases dans les sarcomes pédiatriques est le modèle d’implantation sous-capsulaire tumeur rénale rein qui provoque la formation de tumeurs locales et métastase spontanée aux poumons 12,13. Une technique plus techniquement exigeante comme vidéomicroscopie intravitale peut visualiser directement, en temps réel, interactions entre les cellules de cancer métastatique et la microcirculation d’un site métastatique (ie. poumon ou du foie) tel que décrit par MacDonald14 et Entenberg,15, ou cancer cell extravasation dans la membrane chorio-tel que décrit par Kim, 16.
Le modèle de PuMA est une ex vivo, l’explant tissu pulmonaire, système de culture fermée où la croissance des cellules tumorales fluorescent peut être longitudinalement observée par microscopie de fluorescence au cours d’une période d’un mois (voir la Figure 2 a). Ce modèle récapitule les étapes initiales de la colonisation de poumon (étapes 3 à 5) dans la cascade métastatique. Quelques grands avantages du modèle PuMA par rapport aux modèles classiques in vitro sont : 1) elle offre la possibilité de mesurer la croissance des cellules cancéreuses métastatiques dans un micro-environnement 3D qui conserve de nombreuses caractéristiques du microenvironnement poumon longitudinalement dans vivo 3; 2) puMA permet au chercheur de déterminer si la précipitation d’un traitement de gène ou médicament candidat a une activité anti-métastatique dans le contexte d’un micro-environnement poumon 3D ; 3) le modèle PuMA est souple avec une multitude de plateformes de microscopie de fluorescence (Figure 2 b) comme la microscopie de fluorescence widefield ou microscopie confocale à balayage laser, des exemples de chacun sont montrés dans la Figure 2 -D, respectivement. Cet article discute comment utiliser le modèle PuMA pour obtenir des données d’imagerie longitudinales sur la croissance métastatique de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP)-exprimer, les cellules humaines ostéosarcome métastatique haute et basse (MNNG et HOS cellules, respectivement) à l’aide faible grossissement widefield fluorescence. Exemples d’imagerie un colorant fluorescent qui étiquète le parenchyme pulmonaire et une protéine fluorescente rouge journaliste génétique qui étiquète mitochondries dans les OS des cellules dans le modèle de PuMA à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser sont également discutés.
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Protocol
Tous les protocoles d’animaux d'où proviennent les données d’imagerie ont été effectués avec l’approbation de l’animalier et du Comité d’urbanisme de l’Institut National du Cancer, de la National Institutes of Health. Tous les protocoles animales examiné et décrit dans l’article vidéo ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique.
1. préparation des cellules tumorales pour injection et matériaux pour le modèle de PuMA
Remarque : La quantité de cellules et de la solutions sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour les recettes des médias, se reporter au tableau 1 et tableau 2.
- Réchauffez 5 mL de A-Media dans un tube conique de 15 mL dans un bain-marie à 37 oC.
- Faire fondre la 1,2 % basse fusion agarose solution (dans de l’eau stérile) utilisant le micro-ondes de laboratoire.
- Transférer 5 mL de l’agarose fondu dans un tube conique de 15 mL et garder au chaud dans un bain-marie à 37 oC. Assurez-vous que l’agarose fondu est à 37 oC et liquide avant l’étape d’insufflation pulmonaire.
- Pré refroidissement éolien 30 mL de grade de culture cellulaire PBS additionné de 1 X stylo/strep dans un bac à glaçons.
- Dans un puits d’une plaque 6 puits, pré-tremper une éponge de gélatine dans 1,5 mL de B-médias. L’éponge sera le point d’ancrage de soutien pour les tranches de poumon.
- S’assurer que les cellules d’OS sont environ 70-90 % confluentes sur le jour de l’intervention. Ne pas utiliser de cellules qui sont trop anastomosé ou si le support est orange à jaune car les cellules sont habituellement stressées et ont diminué de viabilité à ce stade. Pour les lignées cellulaires d’ostéosarcome, MNNG et HOS, 5 x 10,5 , dans un volume de 100 μL serviront à injecter dans la veine caudale de 1 souris. Haut de gamme en conséquence si plus de souris sont utilisées pour l’étude.
- Récolter les cellules tumorales à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA (3 mL pour une fiole T75 ou 2 mL dans une boîte de Petri de 10 cm). Lorsque les cellules commencent à décoller de la plaque, neutraliser la trypsine-EDTA avec support complet. Faites tourner les cellules et rincez une fois avec la classe de culture cellulaire PBS. Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.
- Effectuez un comptage cellulaire par des méthodes normalisées. Il est préférable que la suspension de cellules plus que ce qui est réellement nécessaire car perte de suspension cellulaire souvent se produit pendant l’aiguille rédiger et injection tentatives infructueuses.
- Effectuez un test d’Exclusion-le bleu Trypan sur un échantillon de la suspension cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules. Avoir lieu que si la cellule Voir la viabilité de 90 % ou plus.
- Injecter 5 x 105 cellules dans un volume de 100 μL. Pour préparer un excès de 2 X de cette somme, 1 x 106 cellules devraient être tournés vers le bas et resuspendues dans 0,2 mL de HBSS.
- Placez la suspension cellulaire dans un seau à glace tout en préparant les souris pour injection.
2. Injection dans la veine et Lung Insufflation de queue
Remarque : La quantité de solutions et de cellules dans cette section sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour obtenir la liste des équipements, matériaux et instruments chirurgicaux utilisés dans les étapes suivantes, se reporter au tableau 3 et tableau 4.
- Réchauffer une souris femelle (âge 6-8 semaines) sous une lampe chauffante pendant 5 min afin de rendre leur queue veineuse plus visiblement apparente. Pour des cellules K7M2 ou K12, utiliser la souris Balb/c ; pour des cellules humaines, MG63.3, MG63, MNNG et HOS, utiliser la souris de déficit immunitaire combiné sévère.
- Assurez-vous que la suspension cellulaire est uniforme en agitant doucement le tube. Dresser soigneusement la suspension cellulaire dans la seringue de 1 mL sans l’aiguille. Aiguille de calibre Cap la seringue avec un 27. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est sur le même côté que les marques de volume sur l’aiguille.
- Placez votre souris dans la drisse et tamponner la queue avec un imbibé d’alcool.
- Passez à effectuer une injection dans la veine queue et injecter le 100 μl de la suspension cellulaire. 5 min après l’injection, placez la souris dans une chambre de CO2 et commencer le mode opératoire normalisé euthanasie (comme le contour de votre Comité de protection des animaux institutionnelle). Dislocation cervicale ne devrait pas servir de moyen d’euthanasie car la procédure risque d’endommager la trachée.
- Une fois que la souris est euthanasiée, débutez la préparation de la hotte à flux laminaire pour l’insufflation du poumon souris avec la solution d’agarose/A-media. Dans la hotte à flux laminaire, mis en place un espace de travail avec votre tampon stérile. Sur cette touche, vous placerez vos instruments stérilisés, cathéter IV, IV extension ensemble et appareil de perfusion de gravité (voir la Figure 1).
- Placez votre souris en recumbancy dorsale. Avec des ciseaux stériles de petit, disséquer attentivement sur le sternum pour exposer la cavité thoracique. Prenez soin de ne pas perforer le poumon car une solution d’agarose/A-media sera utilisée pour insuffler du poumon.
- Lorsque la dissection sur le sternum, disséquer passé l’entrée thoracique sur les deux côtés la trachée. Exposer la trachée en disséquant loin des tissus mous environnants.
- Canule dans la trachée avec un cathéter IV de 20 calibre. Vaguement un nœud chirurgicale avec suture catgut stérile autour de la trachée canulée.
- Attacher une extension IV la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion de gravité la valeur de la trachée cathétérisée.
- Combiner le pré chauffé 37 oC agarose (5 mL) et A-media (5 mL) dans un mélange 1:1. Verser la solution de gel d’agarose/A-media liquide dans la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion gravité. Avant insufflation des poumons avec une solution d’agarose/A-media, veiller à ce que toute la longueur de l’ensemble de l’extension a été amorcée avec l’agarose/A-media, niant ainsi l’insufflation accidentelle des échantillons pulmonaires à l’air.
- Remplir le poumon l’agarose/A-media solution jusqu'à ce que le poumon est entièrement insufflé.
- Une fois que le poumon est entièrement insufflé, retirer la canule et attacher fermement le noeud chirurgical pour éviter les fuites de la solution de l’agarase/A-media dans la trachée.
- Passez à disséquer sur le courage (trachée, coeur et poumon) de la cavité thoracique. Faites attention à pas de perforation ou d’endommager la surface du poumon.
- Place le pluck (dans aucune orientation particulière) à l’avance réfrigérée 30 mL de PBS additionné de 1 X stylo/strep et permettre l’agarose/A-media solidifier pendant 20 min.
- À l’aide des ciseaux et pince à épiler, couper de petits morceaux du poumon (3 x 1,5 mm) comme le montre la Figure 1 a. Petites tranches de poumon peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un objectif X 2,5. Plusieurs sections peuvent être coupées par les conditions expérimentales, généralement de 4 à 10 tranches par groupe.
Remarque : Pour chaque groupe expérimental, déposer les tranches de poumon dans un puits distinct (plaque 6 puits) contenant une éponge de gélatine de 2 x 2 cm préalablement trempée dans B-médias. Le montant des médias / puits devrait être de 1,5 mL. Modifier les médias tous les 2-3 jours. Pour les études de médicaments, la fréquence de l’évolution des médias/médicament est utilisateur déterminé.
3. Widefield Fluorescence Imaging de tranches de poumon et d’analyse
Remarque : Pour widefield fluorescence imaging, petites tranches sont coupés (3 x 1,5 x 1 mm) afin d’intégrer la section poumon 1 image en utilisant un objectif X 2,5.
Acquisition d’images sur un microscope à fluorescence widefield :
- Tranches de poumon sont généralement imagés à 0, 3, 7 et 14 jours après injection. Dans l’environnement stérile du cabinet biologique, transvaser avec soin les tranches de poumon de la gélatine, éponges à un fond en verre stérile 35 mm rond plat. Prenez soin de dab hors du liquide excédentaire dans la tranche de poumon comme l’excès de liquide va agir comme un miroir et réfléchissent la lumière fluorescente venant de cellules tumorales.
- Disposer les tranches de poumon de façon similaire, représentée dans la Figure 1 a. Chaque colonne représente une condition expérimentale différente. Prenez soin de ne pas la contamination croisée des poumons avec la pince à épiler. Rincer avec de l’éthanol à 70 % et sécher avant de manipuler des tranches de poumon d’un autre groupe expérimental.
- Optimiser les paramètres d’imagerie (ie. gain, décalage, l’exposition le temps, binning) qui offre le meilleur contraste entre les cellules tumorales fluorescent et le tissu pulmonaire arrière-plan du contrôle (véhicule non traitée) groupe. Utilisez les mêmes paramètres appartenant au groupe témoin afin d’imager les groupes expérimentaux. Enregistrer en tant que format d’image tiff.
- Pour une référence de l’échelle, prenez une photo numérique d’un micromètre le même objectif.
- Puisque le poumon auto-fluorescence change au fil du temps, les paramètres d’imagerie doivent être ajustés aux poumons contrôle chaque séance d’imagerie. Les paramètres d’imagerie pour une session ne peuvent pas nécessairement être optimales pour les sessions ultérieures d’imagerie.
Analyse d’images :
Remarque : Les étapes de traitement image suivants sont effectués avec ImageJ 1,51 h software package 17.
- Ouvrir un fichier image dans ImageJ (Figure 3 a).
- Soustraire le fond : processus > soustraire fond > rayon de Rolling ball (Commencez par 50 pixels), décochez la case « Lumière de fond » (Figure 3 b).
- Convertir image en 8 bits format : Image > Type > 8 - bit (Figure 3).
- Valeur des unités de pixels : Image > Enter « Pixels » dans l’unité de longueur, entrez 1 dans « Largeur en pixels », « Hauteur en pixels », « Voxel profondeur ». Case « Global » à appliquer aux images suivantes.
- À l’aide de l’outil de sélection polygone, esquisser la forme de la tranche de l’ensemble du poumon et de déterminer la zone (pixel2) de la tranche totale des poumons. Cette valeur servira à calculer la charge de pourcentage tumeur du poumon.
- Image de seuil : Image > réglage > seuil > souligner « Par défaut » et « B & W » > Utilisez le curseur seuil l’image telle que la majorité des cellules tumorales est correctement mis en évidence. En appuyant sur « Appliquer » se traduira par une image noir et blanc où le poumon est tout noir, et les lésions fluorescentes sont blanches (Figure 3D). Une seconde pression sur « Apply » va inverser l’image où toutes les structures fluorescents sont maintenant des formes noires (Figure 3E).
- Quantification du nombre et la forme de lésions :
Analyser > définir les mesures > Vérifier la « Zone ». Décochez toutes les autres cases.
Analyser les particules > taille (pixels2) : 0-infini représente la plage de formes qui énumère ImageJ. Empiriquement déterminer la plus petite lésion qui est réputée pour être une cellule tumorale unique en images de véhicule jour 0. Utilisez la zone de cette cellule tumorale unique comme la limite inférieure pour les images restantes dans le jeu de données. Pour le travail présenté dans cet article, 11 pixel2 est définie comme la limite inférieure. Pour le œuvre présentée dans l’exemple de vidéo, 24 pixel2 est définie comme la limite inférieure. Gamme « Circularité » laissez 0-1. « Show » peut être définie sur « Nothing ». Par ailleurs, si le « Show » et « Contours » est sélectionné, un dessin de toutes les formes décrites est généré. Consultez « Affichage des résultats » pour une fenêtre séparée des mesures pour faire apparaître. Éventuellement, après avoir « Ajouter au manager » case cochée sauvera toutes les formes quantifiées à un responsable du ROI, qui peut être enregistré pour référence ultérieure. Après avoir appuyé sur OK, une fenêtre de « Résultats » apparaîtra contenant toutes les formes énumérées et les mesures de surface (Figure 3F). - Copiez et collez les données dans la fenêtre « Résultats » dans une feuille de calcul. Utiliser la fonction mathématique de somme dans Excel pour la somme de toutes les zones des lésions métastatiques pour cette tranche particulière de poumon. Pour évaluer la charge de tumeur de poumon pourcentage de tranche de poumon, diviser la somme des superficies des lésions métastatiques de la superficie totale de la tranche du poumon. Ce paramètre est également connu sous le nom de fraction de zone (unA) qui est décrite plus loin par Underwood 18.
Charge de tumeur pulmonaire = somme de domaine domaines/total lésion métastatique de la tranche de poumon - Calculer la charge tumorale pour le reste des sections pulmonaires dans le groupe témoin et autres groupes. Tracer le fardeau de tumeur pulmonaire moyenne par groupe 0, 3, 7 et 14 jours. Représentant widefield images fluorescentes de haute et basse métastatiques cellules OS humains de plus en plus dans le modèle de PuMA aux moments progressive s’affichent (Figure 4 a). Un ligne graphique montrant le pli-changement (normalisé à jour 0) fardeau de la tumeur métastatique pourcentage au fil du temps s’affiche (Figure 4 b).
4. confocal Fluorescence Imaging du modèle PuMA
NOTE : Pour l’imagerie confocale, traitement de tissu est similaire à celle de la section précédente sauf que les plus grandes tranches de poumon sont coupés (coupes transversales complets, 1-2 mm d’épaisseur) afin de permettre plus de ROIs à être photographié.
Étiquetage du parenchyme pulmonaire avec DAR4M :
- Plonger les tranches de poumon en 10 μμM de DAR4M (dans HBSS) pendant 45 min à 37 ° C. DAR4M étiquettes espèces réactives d’azote dans les cellules du poumon.
- Après 45 min d’incubation, rincer les tranches de poumon avec frais HBSS.
- Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.
- Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 5 sont répertoriés dans le tableau 5.
- Acquérir une Z-pile pour une région d’intérêt. Utilisez l’épaisseur de tranche Z suggérée pour l’échantillonnage de Nyquist. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant des cellules d’OS fluorescentes vertes dans le tissu pulmonaire marqué DAR4M est fourni dans Movie 1 et supplémentaire 1 film.
Pour les images confocales d’exemple, illustrés à la Figure 5, la séance d’imagerie a été terminale. Si l’imagerie longitudinale est nécessaire, l’utilisation d’un 2-photon ou multiphotonique équipée LSM microscope confocal pour l’imagerie est conseillée car il est moins photovieillissement à vie tissus19,20.
L’imagerie mito-DP MG63 cellules exprimant dans le modèle de PuMA :
- Effectuer le protocole PuMA comme contour dans étape 1 et 2 avec l’aide de MG63 cellules exprimant la construction mito-DP.
- Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.
- Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 6 sont répertoriés dans le tableau 6. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant les cellules fluorescentes vertes de OS rouge fluorescents mitochondries est fourni dans le film 2 et 2 film supplémentaire.
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Representative Results
Microscopie de fluorescence faible grossissement widefield
Pour la microscopie de fluorescence widefield de tranches de poumon de PuMA, images représentatives et des données de quantification sont indiquées dans la Figure 2et la Figure 4 a et B. Les propensions métastatiques des lignées de cellules métastatiques haute et basse sont visuellement apparentes sur des points de temps progressifs. Cellules MNNG peuvent coloniser efficacement le tissu pulmonaire tandis que les cellules HOS ne peuvent pas cultiver du tout. D’analyse d’image, données quantitatives peuvent être obtenues pour évaluer la croissance au fil du temps, comme le montre le graphique de la Figure 4 b. Acquisition à faible grossissement (X 2,5) est préférable afin de capturer la tranche de poumon entier en une seule image. Cette méthode permet à imagerie par lot d’un grand nombre tranches de PuMA.
Microscopie en fluorescence confocale à fort grossissement
Pour la microscopie confocal de tranches de poumon de PuMA, images représentatives sont indiquées à la Figure 5. Les cellules individuelles exprimant eGFP MG63 peuvent être vu dans la Figure 5 a en ce qui concerne le parenchyme pulmonaire, ce qui est étiqueté par le colorant fluorescent DAR4M dans la Figure 5 b. Une image fusionnée est montrée dans la Figure 5et un zoom image d’une cellule tumorale fluorescente dans un récipient est montré dans la Figure 5. Les films en 3D de la Figure 5 et 5D apparaissent dans 1 film et supplémentaire film 1, respectivement. Imagerie confocale des structures subcellulaires telles que les mitochondries sont indiquées en Figure 6. Cytosolique eGFP-expression permet les cellules tumorales de contour dans la Figure 6 a, et les mitochondries étiquetés avec DP sont indiquées dans la Figure 6 b. Une image fusionnée est vu dans la Figure 6. Films en 3D de la Figure 6 apparaissent dans le film 2 et 2 film supplémentaire. Imagerie des structures subcellulaires telles que la mitochondrie est cumulable avec d’autres étiquettes fluorescentes pour étudier la biologie des organelles dans les cellules d’OS métastatiques. Lorsque vous ajoutez plus d’étiquettes, assurez-vous que les lignes laser et les filtres d’émission sont compatibles avec la fluorophore/fluorescent protéine d’intérêt. Évitez d’imagerie fluorophores/fluorescent protéines dont les spectres d’émission et excitation étroitement se chevauchent.
Figure 1 : Schéma illustrant la cascade métastatique. La cascade métastatique peut être décomposée en plusieurs étapes limitante. (1) métastatique tumeur cellules quitter le site de la tumeur primitive et envahit dans le parenchyme local ; (2) tumeur des cellules intravasating dans les vaisseaux sanguins/lymphatique et de transit dans la circulation. (3) arrestation de cellule tumorale sur le site secondaire ; (4) extravasation de cellules tumorales hors de la microcirculation et la survie du site secondaire ; (5) la croissance dans les micrométastases ; (6) la croissance dans des tumeurs métastatiques manifestes vascularisées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Tranches de poumon de PuMA d’imagerie utilisant widefield fluorescence et plateformes de microscopie confocal fluorescence. (A) tranches de PuMA exemple figurent dans un plat de 35 mm de fond en verre. (B) confocal microscope appareils. (C) exemple d’image faible grossissement d’une tranche de PuMA avec des cellules d’OS eGFP-expression. Échelle d’une = 0,5 mm ; D image confocale par exemple d’une sous-région d’une tranche de PuMA. Échelle d’une = 100 μm. (*) Parenchyme pulmonaire est étiqueté rouge par DAR4M (voir encadré) et (∇) pointent vers les cellules de MG63 exprimant eGFP. Échelle d’une = 30 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Traitement d’une image de faible grossissement d’une tranche de PuMA avec ImageJ. (A) image originale de PuMA. B la soustraction du fond. (C) la Conversion d’une image de 8 bits. (D) seuillage de l’image pour mettre en surbrillance des cellules tumorales fluorescent. (E) inversion d’image. (F) l’énumération des formes discrètes et quantification des zones de forme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Faible grossissement séries images montrant la croissance des OS humains faibles et hautement métastatiques de cellules dans le modèle de PuMA au fil du temps. (A) serial image fortement métastatiques MNNG cellules et faible métastatique HOS sont affichées à 0, 3, 7 et 14 jours après injection. MNNG cellules sont capables de se développer mieux dans le microenvironnement de poumon par contraste avec les cellules HOS. Échelle d’une = 1 mm. (B) changement de pli en charge pourcentage de tumeur métastatique à cellules MNNG et HOS au fil du temps sont affichés sous forme de graphiques linéaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Microscopie confocale d’une tranche de poumon PuMA marqués DAR4M. Une image confocale représentative des cellules MG63 exprimant eGFP dans les tissus pulmonaires PuMA marquées avec DAR4M. (A) vert canal montrant les cellules exprimant eGFP de MG63 (∇). B canal rouge montrant la teinture de DAR4M liant aux espèces réactives d’azote dans les cellules du parenchyme pulmonaire. La teinture met en évidence le parenchyme pulmonaire (#) et des structures ressemblant à un vaisseau sanguin (*). Le bord du PuMA poumon section est notée (↓). (C) : fusion image verte et rouge. Échelle d’une = 100 μm. D une image agrandie de la case blanche en pointillés (à partir de C) montre une cellule tumorale dans un récipient. Échelle d’une = 50 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Microscopie confocale des mitochondries dans les cellules d’ostéosarcome dans le modèle PuMA. Une image confocale représentative des mitochondries dans les cellules MG63 exprimant eGFP. (A) vert canal montrant les cellules exprimant eGFP de MG63 (∇). B canal rouge montrant la DP localisée dans les mitochondries (*). (C) : fusion image verte et rouge. Échelle d’une = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Milieux de culture | Recette |
| Support complet (500mL) | •440 mL DMEM |
| •50 mL FBS | |
| •5 mL 10 X solution Pen/strep (10000U/mL) | |
| •5 mL L-Glutamine (200 mM) | |
| A-Media (250mL) | •177.58 mL d’eau stérile |
| •50 mL 10 X support de M-199 | |
| •15 mL de solution de bicarbonate de sodium 7,5 % | |
| •2.25 mL d’hydrocortizone 50 mM | |
| •125 mL d’acétate de rétinol 0,4 mg/ml (dans de l’eau stérile) | |
| •5 mL 10 X solution Pen/strep (10000U/mL) | |
| •50 mL de 10mg/ml d’insuline bovine | |
| B-médias (500ml) | •427.6 mL d’eau stérile |
| •50 mL 10 X support de M-199 | |
| •15 mL de solution de bicarbonate de sodium 7,5 % | |
| •2.25 mL d’hydrocortizone 50 mM | |
| •125 mL d’acétate de rétinol 0,4 mg/ml (dans de l’eau stérile) | |
| •5 mL 10 X solution Pen/strep (10000U/mL) | |
| •50 mL de 10mg/ml d’insuline bovine |
Tableau 1. Recettes pour les médias, A, B-médias. Recettes de culture cellulaire et de médias pour le dosage de PuMA sont répertoriés.
| Réactifs de Culture cellulaire | Description | No de catalogue : | Compagnie |
| MNNG-HOS | lignée de cellules fortement métastatique OS | CRL-1547 | ATCC |
| HOS | lignée de cellules des OS mal métastatique | CRL-1543 | ATCC |
| MG63.3 | lignée de cellules fortement métastatique OS | N/A | Amy LeBlanc laboratoire (NCI) |
| MG63 | lignée de cellules des OS mal métastatique | CRL-1427 | ATCC |
| 10 X M199 médias | Base multimédia pour A-media et B-médias | 11825015 | Thermofisher |
| Eau distillée (stérilisé) | Composant A-médias & | 15230-147 | Thermofisher |
| B-médias | |||
| 7,5 solution de bicarbonate de sodium % | Composant A-médias & | 25080094 | Thermofisher |
| B-médias | |||
| Hydrocortizone | Composant A-médias & | H6909 | Sigma-Alrich |
| B-médias | |||
| Soluble à l’eau acétate rétinol | Composant de médias-A & B-médias | R0635 - 5MG | Sigma-Alrich |
| Solution de pénicilline/streptomycine 10 X concentré (10 000 U/ml) | Composant A-médias & | 15140122 | Thermofisher |
| B-médias, complet | |||
| Solution de l’insuline bovine (10mg/ml) | Composant A-médias & | I0516 - 5ML | Sigma-Alrich |
| B-médias | |||
| DMEM, hyperglycémie | Support base de médias complet | 11965092 | Thermofisher |
| L-Glutamine (200 mM) | Composant de médias complet | 25030081 | Thermofisher |
| Sérum de veau fœtal | Composant de médias complet | 16000044 | Thermofisher |
| Solution Saline tamponnée au Phosphate de Dulbecco | Utilisé en culture cellulaire | 14190144 | Thermofisher |
| Hank sels Solution tampon, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol | Utilisé pour remettre en suspension le culot cellulaire avant l’injection | 14175095 | Thermofisher |
| La trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol | Utilisé en culture cellulaire | 25200114 | Thermofisher |
| DAR4M | Utilisé pour étiqueter le parenchyme pulmonaire | ALX-620-069-M001 | Enzo |
Le tableau 2. Les réactifs de la culture de cellules pour A-media B-médias et toutes les médias. Composants pour les recettes de médias, réactifs et les tampons sont répertoriés avec nom de nombre et de la société catalogue.
| Matériaux | Description | No de catalogue : | Compagnie |
| LSM Confocal Zeiss 710 | Microscope confocal droit LSM | N/A | Zeiss |
| LSM Confocal Zeiss 780 | Microscope confocal inversé LSM | N/A | Zeiss |
| Souris SCID | CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, femelle, age 6-8 semaines | N/A | Charles River |
| GelFoam | Utilisé comme support pour des sections de tissu pulmonaire | 59-9863 | Appareil de Harvard |
| SeaPlaque gel d’Agarose | Utilisé au cours de l’insufflation du poumon | 50100 | Lonza |
| aiguille de la seringue de 1 ml avec 27 gauge | Utilisé pour l’injection dans la veine queue | Fisherscientific | |
| 14-826-87 | |||
| seringue de 10 ml | Utilisé pour l’insufflation du poumon | 309604 | BD |
| cathéter de calibre 20 | Utilisé au cours de l’insufflation du poumon | SR-OX2032CA | Terumo |
| Ensemble de rallonge de Abbott IV (30", stérile) | Utilisé au cours de l’insufflation du poumon | 8342 | Medisca |
| Tampons d’alcool | Pour essuyer la queue veineuse avant l’injection | 326895 | BD |
| Gants chirurgicaux stériles | Asceptic remise des poumons de souris | Varie en fonction de la taille | Fisherscientific |
| règle 30 cm | Utilisé pour l’insufflation du poumon | Staples | |
| Stand de soutien pour dirigeant | Utilisé pour l’insufflation du poumon | HS29022A | Pipette.com |
| boîte de Petri à fond de verre de 35 mm | Utilisé en imagerie de tranches de poumon | 81158 | Ibidi |
| Alèses absorbantes avec pare-vapeur étanche | Utilisé à la ligne de l’aire de travail stérile dans la hotte biologique | 56617-014 | VWR |
| Plaine de catgut résorbable | Utilisé pour attacher la trachée canulée | N/A | Braun |
Tableau 3. Matériaux pour PuMA. Matériaux requis pour le protocole de PuMA sont répertoriés avec le nom de nombre et de la société catalogue.
| Matériaux | Description | No de catalogue : | Compagnie |
| Dissection micro ciseaux 3.5" droite pointue/pointue | Pour la coupe des sections du poumon | RS-5910 | ROBOZ |
| 4"(10 cm) Long dentelée droite pointe Extra délicat 0,5 mm | Pour les sections de manipulation/rétention pulmonaire | RS-5132 | ROBOZ |
| Pointe de 0,8 mm longs dentelée courbe légère 4"(10 cm) | Pour les sections de manipulation/rétention pulmonaire | RS5135 | ROBOZ |
| Le pouce s’habiller Forceps ; Dentelé ; Délicat ; 4.5" longueur ; Largeur de pointe de 1,3 mm | Pour la dissection générale | RS-8120 | ROBOZ |
| Le pouce s’habiller pince dentelée de 4.5" largeur de pointe de 2,2 mm | Pour la dissection générale | RS-8100 | ROBOZ |
| Extrafine Micro ciseaux de disséquant 3.5" droite pointue/pointue, lame de 20mm | Pour la dissection générale | RS-5880 | ROBOZ |
| Knapp ciseaux ; Ligne droite ; Sharp-Blunt ; Longueur de lame de 27mm ; 4" longueur totale | Pour la dissection générale | RS-5960 | ROBOZ |
Tableau 4. Instruments chirurgicaux pour PuMA. Divers instruments en acier inoxydable utilisés dans le protocole sont répertoriés avec le nom de nombre et de la société catalogue.
| Paramètres | laser à 488 | 561 laser | |
| objectif | Zeiss W N-Achroplan 10 x / 0,3 W (DIC) M27 | ||
| puissance | 2 % | 2 % | |
| Dwell pixel | 1.61 | 1.61 | |
| Moyenne | 0 | 0 | |
| Zoom | 1 | 1 | |
| Gain Master | 820 | 814 | |
| Gain numérique | 1 | 0,51 | |
| Offset numérique | -4,5 | -9.24 | |
| Sténopé | 51 | 57 | |
| Filtre accordable | 496-553 | 570-618 | |
Tableau 5. Paramètres pour l’imagerie confocale des sections marquées DAR4M PuMA. Paramètres d’image spécifique utilisés pour les images confocales dans le document a obtenu sont fournis dans le tableau.
| Paramètres | laser à 488 | 561 laser | |
| objectif | Plan-Apochromat 63 x / 1,40 Oil DIC M27 | ||
| puissance | 2 % | 2 % | |
| Dwell pixel | 0,6 | 0,6 | |
| Moyenne | 2 (ligne) | 2 (ligne) | |
| Zoom | 2.3 | 2.3 | |
| Gain Master | 449 | 390 | |
| Gain numérique | 1 | 1.23 | |
| Offset numérique | 0 | 0 | |
| Sténopé | 136 | 136 | |
| Filtre accordable | 493-550 | 566-703 | |
Tableau 6. Paramètres pour l’imagerie confocale des mitochondries des cellules MG63 dans les sections de PuMA. Paramètres d’image spécifique utilisés pour les images confocales dans le document a obtenu sont fournis dans le tableau.
Supplémentaire Figure 1 : appareil de perfusion gravité. L’appareil de perfusion gravité est utilisée pour insuffler du poumon avec une solution liquide d’agarose/A-media à 20 cm de la pression hydrostatique de H20. La solution d’agarose/A-media est versée dans la seringue de 10 mL, qui est attachée par une extension IV sur la trachée canulée (non illustrée). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Movie 1 : Rotation d’une image 3D confocal z-pile d’OS exprimant eGFP cellules dans une tranche de poumon PuMA marqués DAR4M. DAR4M (canal rouge) est utilisé pour mettre en évidence de parenchyme pulmonaire et exprimant eGFP MG63 cellules peuvent également être vu (couche verte). Échelle d’une = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce move.
Movie 2 : Rotation d’une image 3D confocal z-pile des mitochondries marqués au DP en exprimant eGFP OS cellules dans le modèle PuMA. Subcellulaires organites comme les mitochondries sont montrés étiquetées avec DP (canal rouge) dans les cellules MG63 exprimant eGFP (couche verte) dans le modèle de PuMA. Échelle d’une = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce move.
Supplémentaire 1 film : film en 3D avec zoom d’une cellule d’OS métastatique dans un vaisseau dans le poumon. Une cellule MG63 exprimant eGFP est montrée dans la cuve dans le microenvironnement de poumon. Échelle d’une = 30 μM. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce move.
Supplémentaire 2 film : film en 3D avec zoom de mitochondries dans une cellule d’OS métastatique dans le poumon. Mitochondries étiquetés avec DP apparaissent en MG63 les cellules dans le microenvironnement de poumon. Échelle d’une = 5 μM. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce move.
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Discussion
L’article technique suivant décrit certains aspects pratiques du modèle PuMA dans l’étude de colonisation de poumon dans les OS. Certaines étapes critiques du protocole où les chercheurs devraient prendre des précautions supplémentaires sont les suivantes :
un) canulation de la trachée. La trachée peut être facilement endommagée en disséquant les muscles environnants et le tissu conjonctif. En outre, l’aiguille du cathéter peut facilement être poussé à travers la trachée. Porter une attention particulière à la façon dont le biseau de l’aiguille pénètre dans la trachée lors de l’insertion de la canule.
b) perforer ou endommager la surface du poumon. Le poumon peut être facilement crevé ou endommagé avec dissection des ciseaux tout en enlevant le sternum et en exposant la cavité thoracique. Soyez prudent lorsque la dissection sur le courage de la cavité thoracique. Perforer ou endommager la surface du poumon provoquera l’agarose/A-media liquide à écouler et le poumon va être dégonflé.
c) supprimer les excès médiatique de poumon sections tout en imagerie. Des milieux liquides excédentaires entourant la section pulmonaire peuvent provoquer un effet « miroir » vus au microscope. L’excès de liquide peut refléter la lumière fluorescente de cellules tumorales exagérant ainsi la zone de fluorescence dans l’image. Enlèvement du liquide excédentaire médias permettra d’éviter cet artefact dans l’image. Par ailleurs, l’artefact de l’image peut être enlevée dans le post-traitement des images.
d) photovieillissement des tissus vivants. Lorsque vous utilisez une ampoule mercure ou des lasers d’un microscope 1-photon, veillez à limiter le temps d’exposition à la lumière. Le pourcentage d’intensité/puissance de la source lumineuse peut également être réduit. Une surexposition à la source de lumière peut causer photovieillissement pour le tissu pulmonaire. Microscopes équipés avec des diodes électroluminescentes (LED) ou 2-photon/multi-photon microscopes serait idéales, car ils produisent moins photovieillissement pendant les études d’imagerie longitudinales.
Le modèle PuMA peut être adapté et modifié afin d’étudier plusieurs aspects du processus de colonisation du poumon. Une autre variante de cette approche ex vivo est décrite par van den Bijgaart et ses collègues 21. Pour les études examinant les effets de l’activité du gène médicament anti-métastatiques ou précipitation sur la croissance des cellules tumorales dans le poumon, mise à l’échelle le nombre de cellules injectées de 5 x 105 3 x 105 retour est conseillé car les effets de l’intervention peuvent être masqués au cours de la croissance exponentielle d’un inoculum de cellule plus grande. Plusieurs études ont utilisé le modèle PuMA pour étudier les pilotes du poumon métastatique progression 4,5,8,22,23,24. Divers colorants indicateur fluorescent ou gènes rapporteurs fluorescent peuvent servir pour marquer les cellules tumorales pour vérifier les modifications dans la cellule physiologie ou gene expression 8 dans le microenvironnement de poumon.
Une des limitations du modèle PuMA comprennent un nombre limité de lignées cellulaires compatibles. Les lignées cellulaires établies compatibles avec ce test sont énumérées par Mendoza et ses collègues 3 . Pour les lignées de cellules d’ostéosarcome métastatique haute et basse, les paires de suivre des lignées cellulaires liés par clonage ; ont à développer et maintenir leur propension métastatique dans le modèle de PuMA : les cellules humaines de MG63.3 & MG63, MNNG & 143 ter et cellules HOS, murin K7M2 et K12 cellules. Les chercheurs doivent déterminer empiriquement ou non leurs lignées cellulaires peuvent demeurer viables dans B-médias. Une autre limitation à considérer est la longueur limitée de temps, que les tissus des poumons peuvent être maintenues in vitro. Les tissus pulmonaires peuvent retenir ses composants cellulaires pendant 30 jours, au-delà de cette époque et les composants cellulaires du poumon commencent à mourir. Donc étudier les interactions entre cellules tumorales et des cellules stromales pulmonaire ne doit pas dépasser 30 jours.
Le modèle PuMA fournit une méthode sans précédent afin d’étudier comment métastatique OS cellules colonisent les tissus pulmonaires. L’aspect le plus frappant du modèle PuMA vient du fait que plusieurs faible métastatique OS lignées cellulaires (HOS, MG63, K12), dont phénotypes in vivo ont été caractérisés ailleurs 25, ne peut se développer dans le modèle de PuMA. En revanche, par clonage des cellules d’OS fortement métastatiques (MNNG, MG63.3, K7M2) ont une plus grande propension à coloniser les tissus pulmonaires en vivo25 et dans le PuMA modèle. Ceci suggère que les composants cellulaires et extracellulaires du microenvironnement de poumon qui empêchent la croissance in vivo, basses lignées de cellules des OS métastatiques sont toujours maintenues dans le modèle PuMA malgré le manque de circulation sanguine. En d’autres termes, le microenvironnement de poumon du modèle PuMA exerce encore une « pression de sélection » qui empêche les cellules d’OS métastatiques faibles de se développer dans le poumon. En effet, étudier des cellules OS métastatiques élevés poussent dans PuMA a été utile dans l’identification de nouveaux pilotes moléculaires du phénotype métastatique 4,5. En outre, génétique la modulation des objectifs dudit dans des cellules fortement métastatiques s’est avérée réduire capacité métastatique dans le modèle PuMA et in vivo 5. Pour les études de candidat médicament anti métastatique, le PuMA modèle peut être utilisé pour déterminer quelle gamme de concentration peut réduire l’excroissance métastatique dans les tissus pulmonaires, qui à son tour, peut ensuite être validée en vivo.
Futures applications de ce modèle devraient exploiter la pléthore de colorants fluorescents disponibles dans le commerce et les gènes afin de plonger en profondeur dans la biologie fondamentale de la progression des métastases OS. Par exemple, colorants fluorescents comme 2', 7' - dichlorofluorescin diacétate ou dihydroethidium peuvent servir à évaluer l’état redox des cellules tumorales dans le modèle de PuMA. Les gènes fluorescents peuvent être utilisés pour étudier la biologie de l’organite ou évaluer l’activité du promoteur pour déterminer quelles voies de signalisation sont activés dans les cellules d’OS fortement métastatiques lors du processus de colonisation. Ces approches permet de visualiser si un traitement médicamenteux a une activité dans les cellules tumorales qui poussent dans le poumon. Plateformes de microscopie fluorescente qui produisent moins photovieillissement aux tissus, microscopes équipés de LED ou 2-photon/multiphoton microscopes confocaux, peut être utilisé comme étudient comment métastatique OS cellules migrent et envahir tout au long des tissus pulmonaires. En outre, des interactions entre cellules tumorales et des cellules stromales de poumon adhérence peuvent être contrôlées avec les gènes fluorescents.
Pour résumer, le présent document examine les aspects pratiques du modèle PuMA, d’abord développée par Mendoza et ses collègues 3. Un exemple d’utilisation faible grossissement, la microscopie de fluorescence widefield et microscopie confocale haute résolution afin d’évaluer la croissance des cellules métastatiques haute et basse d’OS humains est montré. Plusieurs étapes critiques du protocole ont été décrits. En outre, les avantages et les limitations du modèle PuMA ont été discutées. Les applications futures du modèle PuMA pour étudier le processus de colonisation du poumon ont été avancées, et il est à espérer que ce modèle aura une utilisation plus large dans la communauté des chercheurs ostéosarcome.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Arnulfo Mendoza qui a dispensé une formation à la technique de PuMA. En outre, nous tenons à remercier les Drs Chand Khanna, Susan Garfield (NCI/NIH) et Sam Aparicio (BC Cancer Agency) permettant l’utilisation de leurs microscopes au cours de cette étude. Cette recherche a été financée (en partie) par le programme de recherche intra-muros de la National Institutes of Health, centre de recherche sur le Cancer, service d’oncologie pédiatrique. M.M.L. a été soutenu par le National Institutes of Health intra-muros visitant Fellow Program (prix 15335) et est actuellement soutenue par une bourse de Parker de Joan dans la recherche de métastases. P.H.S. est pris en charge par la British Columbia Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 2 | |||
| Cell culture reagents for A-media, B-media, and complete media | |||
| MNNG-HOS | ATCC | CRL-1547 | highly metastatic OS cell line |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | poorly metastatic OS cell line |
| MG63.3 | Amy LeBlanc Laboratory (NCI) | N/A | highly metastatic OS cell line |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | poorly metastatic OS cell line |
| 10X M199 media | Thermofisher | 11825015 | Base media for A-media and B-media |
| Distilled Water (sterilized) | Thermofisher | 15230-147 | Component of A-media & B-media |
| 7.5% sodium bicarbonate solution | Thermofisher | 25080094 | Component of A-media & B-media |
| Hydrocortizone | Sigma-Alrich | H6909 | Component of A-media & B-media |
| Retinol acetate-water soluable | Sigma-Alrich | R0635-5MG | Component of A-media & B-media |
| Penicillin/Streptomycin 10X concentrated (10000 U/ml) solution | Thermofisher | 15140122 | Component of A-media & B-media, complete media. |
| Bovine insulin solution (10mg/ml) | Sigma-Alrich | I0516-5ML | Component of A-media & B-media |
| DMEM, high glucose | Thermofisher | 11965092 | Base media of Complete Media |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher | 25030081 | Component of Complete Media |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 16000044 | Component of Complete Media |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Thermofisher | 14190144 | Used in cell culture. |
| Hank’s Buffered Salts Solution, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermofisher | 14175095 | Used to resuspend cell pellet prior to injection |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermofisher | 25200114 | Used in cell culture. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | Used to label lung parenchyma. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 3 | |||
| Materials for PuMA | |||
| Zeiss 710 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Upright LSM confocal microscope |
| Zeiss 780 Confocal LSM | Zeiss | N/A | Inverted LSM confocal microscope |
| SCID mice | Charles River | N/A | NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl, female, age 6-8 weeks |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | Used as a support for lung tissue sections. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | Used during insufflation of the lung. |
| 1 ml syringe with 27 gauge needle | Fisherscientific | 14-826-87 | Used for tail vein injection. |
| 10 ml syringe | BD | 309604 | Used for insufflation of the lung. |
| 20 gauge catheter | Terumo | SR-OX2032CA | Used during insufflation of the lung. |
| Abbott IV extension set (30", Sterile) | Medisca | 8342 | Used during insufflation of the lung. |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | For wiping tail vein before injection |
| Sterile surgical gloves | Fisherscientific | Varies with size | Asceptic handing of mouse lungs |
| 30 cm ruler | Staples | Used for insufflation of the lung. | |
| Support stand for ruler | Pipette.com | HS29022A | Used for insufflation of the lung. |
| 35 mm glass-bottomed culture dish | Ibidi | 81158 | Used during imaging of lung slices |
| Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | Used to line the sterile work area in the biological hood. |
| Catgut Plain Absorbable Suture | Braun | N/A | Used to tie off cannulated trachea. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 4 | |||
| Surgical instruments for PuMA | |||
| Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-5910 | For cutting lung sections |
| 4” (10 cm) Long Serrated Straight Extra Delicate 0.5mm Tip | Roboz | RS-5132 | For manipulating/holding lung sections. |
| 4” (10 cm) Long Serrated Slight Curve 0.8mm Tip | Roboz | RS5135 | For manipulating/holding lung sections. |
| Thumb Dressing Forceps; Serrated; Delicate; 4.5" Length; 1.3 mm Tip Width | Roboz | RS-8120 | For general dissection. |
| Thumb Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz | RS-8100 | For general dissection. |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp, 20mm blade | Roboz | RS-5880 | For general dissection. |
| Knapp Scissors; Straight; Sharp-Blunt; 27mm Blade Length; 4" Overall Length | Roboz | RS-5960 | For general dissection. |
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