JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Differentiatie van muis embryonale stamcellen in de corticale Interneuron precursoren

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Dit protocol wordt een methode voor het genereren van corticale interneuron progenitoren en post mitotische interneuron precursoren van muis embryonale stamcellen met een gewijzigde embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde methode beschreven. Deze progenitoren/precursoren kunnen worden gebruikt in vitro fluorescently gesorteerd en getransplanteerd in neonatale neocortex voor het bestuderen van de bepaling van het lot of gebruikt in therapeutische toepassingen.

Abstract

GABAergic corticale interneuronen zijn een heterogene populatie van cellen die spelen een kritieke rol in de uitvoer van excitatory piramidale neuronen reguleren, alsmede het synchroniseren van de uitgangen van de piramidale neuron ensembles. Tekorten in interneuron functie zijn betrokken bij allerlei neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder schizofrenie, autisme en epilepsie. De afleiding van corticale interneuronen vanaf embryonale stamcellen niet alleen voorziet in de studie van hun ontwikkeling en functie, maar verschaft inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van corticale interneuron-gerelateerde aandoeningen. Interneuronen ook de opmerkelijke capaciteit hebben om te overleven, migreren en integreren van host corticale circuits na transplantatie, waardoor ze ideale kandidaten voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën. Hier presenteren we een schaalbare, uiterst efficiënte, bewerkt, embryoid lichaam-aan-enkelgelaagde-methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van muis embryonale stamcellen (mESCs). De opdrachtregel Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC, kunnen Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen worden geïsoleerd via fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. We bieden ook methoden om te verrijken voor parvalbumin (PV) of Somatostatine (SST) interneuron subgroepen, die nuttig kan zijn voor het bestuderen van aspecten van lot bepaling of voor gebruik in therapeutische toepassingen die van interneuron deelgroep profiteren zouden-verrijkt transplantatiecentra.

Introduction

In zowel mens als muizen, ongeveer de helft van alle corticale remmende interneuronen (CIns) hun oorsprong vinden binnen een voorbijgaande subcorticale structuur die bekend staat als de mediale ganglionaire eminentie (MGE), waar de neuroepithelial progenitorcellen van CIns en andere neuronale en gliale subgroepen express de transcriptiefactor Nkx2.11,2. CIn subgroepen of subtypen worden gedefinieerd door de doorsnede van de morfologische, neurochemical, elektrofysiologische en connectiviteit kenmerken3,4. De CIns MGE-afgeleid kunnen worden gegroepeerd in meestal niet-overlappende subgroepen op basis van hun uitdrukking van PV of SST, de uitdrukking van welke correlaten met name elektrofysiologische en connectiviteit tendensen5. Dysfunctie van interneuronen, vooral die in de PV deelgroep, heeft betrokken bij meerdere neuropsychiatrische stoornissen en ziekten6,7. Het algemene doel van deze methode is mitotische progenitoren stamcel-afgeleide en trekkende precursoren verrijkt voor PV of SST CIn lot voor de studie van biologie van de corticale interneuron en voor gebruik in cel-gebaseerde therapieën te produceren.

We hebben een schaalbare, uiterst efficiënte methode voor de afleiding van de Nkx2.1-uiten interneuron progenitoren en hun nakomelingen van mESCs ontwikkeld. Met behulp van een Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever mESC lijn8, Nkx2.1 progenitoren of hun Lhx6-uiten na mitotische nakomelingen kunnen worden geïsoleerd via FACS en vervolgens gebruikt in een aantal downstream toepassingen. Door het manipuleren van een aantal signaalroutes, duur van de cultuur, en de wijze van neurogenese, kunnen we miljoenen fluorescently geëtiketteerde interneuron precursoren geschikt voor tal van downstream toepassingen.

Hoewel er verschillende andere methoden bestaan voor het genereren van MGE-achtige voorlopercellen van mESCs9,10,11,12,13,14, onze werkwijze, die gebaseerd op de Wnt is antagonist XAV-939, is bijzonder efficiënt op het genereren van Foxg1/Nkx2.1 mede uiting van telencephalic voorlopercellen. Daarnaast verbetert de mogelijkheid om te kiezen voor interneuron progenitoren of hun post mitotische Lhx6-uiten nageslacht via ons systeem van de dubbele verslaggever, sterk het vermogen om verschillende progenitoren en hun nakomelingen te genereren.

Protocol

Opmerking: De dubbele verslaggever mESC regel beschreven in dit protocol is beschikbaar op verzoek (sande@mail.med.upenn.edu). 1. Media voorbereiding Opmerking: Warm alle media tot 37 ° C vóór gebruik in celkweek. Muis embryonale Fibroblast (MEF) media (voor het voorbereiden van 500 mL) Meng 50 mL foetale runderserum (FBS) 449 mL Dulbecco van bewerkt Eagle’s Medium (DMEM), en filter via een 500 mL 0,22 µm porie filter eenhei…

Representative Results

Het protocol beschreven in dit document is een gewijzigde versie van onze gepubliceerde protocollen15,16,17 en is geoptimaliseerd voor gebruik met onze Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC lijn. Door het toevoegen van de Wnt-remmer XAV-939 van DD0-5, gecombineerd met het opnieuw plating op DD8, bereiken wij robuuste Nkx2.1 inductie, waarin meer dan 50% van alle DAPI + kernen in cultuur oo…

Discussion

Hoewel deze methode is zeer effectief bij patronen J1-afgeleide mESCs (SCRC-1010), hebben we ervaren variabele succes met andere mESC lijnen en klonen isolaten. Bijvoorbeeld, Foxg1::venus mESCs (EB3-afgeleid; Danjo et al. 13) reageren slecht bij dit protocol en de Foxg1 inductie door DD12 is meestal over de volgorde van 1-2%. Om redenen die wij niet volledig begrijpen, produceert een andere Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual verslaggever kloon (zogenaamde JQ59) dat werd geïsoleerd gelijktijd…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn dankbaar Qing Xu voor de ontwikkeling van de Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual verslaggever mESC lijn evenals Jennifer Tyson Asif Maroof en Tim Petros voor hun vroege werk op het helpen ontwikkelen van dit protocol. Wij danken ook de CHOP stroom cytometry kern voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door een NIH R01 MH066912 (nv) en de F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Keywords: Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
check_url/56358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image