JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Bu iletişim kuralı kortikal interneuron ataları ve sonrası Mitotik interneuron öncüleri fare embriyonik kök değiştirilmiş bir embryoid vücut monolayer yöntemi kullanarak hücre oluşturmak için bir yöntem açıklanır. Bu ataları/hareketlenme öncesi ilk belirtiler kullanılan vitro olabilir fluorescently sıralanmış ve kader tayini çalışmak için yenidoğan yeni korteksimiz içine nakledilen veya tedavi uygulamalarında kullanılan.

Abstract

GABAergic kortikal interneurons heterojen bir nüfus eksitatör piramidal nöronların çıkışını düzenleyen hem de piramidal nöron topluluklar çıkışlarını eşitleme kritik rol oynarlar hücre vardır. İnterneuron işlevinde açıkları nöropsikiyatrik bozukluklar, şizofreni, otizm ve epilepsi gibi çeşitli karıştığı olmuştur. Embriyonik kök hücrelerden kortikal interneurons türetme sadece kendi geliştirme ve fonksiyon incelenmesi için izin verir, ama kortikal interneuron ile ilgili bozukluklar patogenezinde temel moleküler mekanizmaları görmemizi sağlar. İnterneurons da hayatta, göç ve bütünleşmek içine ana bilgisayar kortikal devresi sonrası nakli, yapım onları kullanmak için ideal aday hücre tabanlı terapiler için olağanüstü kapasitesine sahip. Burada, bir ölçeklenebilir, yüksek verimli, değiştirilmiş embryoid vücut monolayer yöntemi interneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl fare embriyonik kök hücreler (mESCs) üzerinden türetme için mevcut. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift muhabir mESC satırını kullanarak, Nkx2.1 ataları veya onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl olabilir (FACS) sıralama Floresans aktif hücre ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Ayrıca parvalbumin (PV) veya somatostatin için (SST) interneuron alt grupları, hangi-ebilmek var olmak yararlı kader tayini yönlerini çalışmak için veya kullanmak için alt grubu vitaminlerle zenginleştirilmiş interneuron yararlanacak terapötik uygulamalarda zenginleştirmek için yöntemler sağlar nakillerine.

Introduction

Fareler ve insanlar içinde kabaca tüm kortikal inhibitör interneurons (CIns) yarısı nerede medial ganglionic hazretleri (MGE) bilinen bir geçici subcortical yapısı içinde kaynaklanan neuroepithelial ataları, CIns ve diğer nöronal ve gliyal alt gruplar transkripsiyon faktörü Nkx2.11,2hızlı. CIn alt gruplar veya alt türlerinden kesişen morfolojik, nörokimyasal, Elektrofizyolojik ve bağlantı özellikleri3,4tarafından tanımlanır. MGE elde edilen CIns gruplandırılabilir çoğunlukla üst üste alt gruplar PV veya SST, hangi ilişkilendirir belirli Elektrofizyolojik ve bağlantı eğilimler5ile ifade onların ifade dayalı. İşlev bozukluğu interneurons, özellikle o PV alt grubu içinde birden çok nöropsikiyatrik bozukluklar ve hastalıklar6,7‘ karıştığı olmuştur. Bu yöntem genel amacı Mitotik ataları kök hücre kaynaklı ve göçmen öncüleri PV veya SST CIn kader kortikal interneuron biyoloji okuyan ve kullanılmak üzere hücre tabanlı terapiler için zenginleştirilmiş üretmektir.

İnterneuron ataları Nkx2.1 ifade etmek ve onların döl mESCs gelen türetme ölçeklenebilir ve yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP kullanarak çift muhabir mESC kaplamak8, Nkx2.1 ataları ya da onların Lhx6 ifade sonrası Mitotik döl FACS yolu ile izole ve daha sonra aşağı akım uygulamaları bir dizi kullanılacaktır. Sinyal yolları bir dizi, kültür süresi ve neurogenesis modu manipüle ederek, biz fluorescently etiketli interneuron öncüleri aşağı akım uygulamaları bir dizi için uygun milyonlarca alabilirsiniz.

MESCs9,10,11,12,13,14, Wnt üzerinde dayanır bizim yöntem MGE benzeri ataları oluşturmak için birkaç yöntem mevcut olmasına rağmen antagonist XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 telencephalic ataları ortak ifade oluşturma özellikle verimli. Buna ek olarak, interneuron ataları veya onların sonrası Mitotik Lhx6 ifade döl çift muhabir sistemimiz üzerinden seçin yeteneği büyük ölçüde farklı ataları ve onların döl üretmek için kapasite artırır.

Protocol

Not: Bu protokol için açıklanan çift muhabir mESC hattı (sande@mail.med.upenn.edu) istek üzerine sağlanmaktadır. 1. medyası hazırlama Not: tüm medya hücre kültüründe kullanmadan önce 37 ° c sıcak. Fare embriyonik Fibroblast (MEF) medya (hazırlığı 500 mL) Dulbecco’nın modifiye kartal orta (DMEM) ve bir 500 mL 0,22 µm gözenek filtre ünitesi filtreden 449 ml 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyin. …

Representative Results

Bu raporda açıklanan iletişim kuralı bizim yayımlanmış protokolleri15,16,17 değiştirilmiş bir versiyonu ve Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP çift-muhabir mESC hattımız ile kullanım için optimize edilmiştir. DD0-5 DD8 yeniden kaplama ile birlikte, Wnt inhibitörü XAV-939 ekleyerek neyin yukarı tüm DAPI + çekirdeği kültüründe % 50’si de Nkx2.1 (şekil 1A</strong…

Discussion

Bu yöntem J1 kaynaklı mESCs (SCRC-1010) desenlendirme son derece etkili olmakla birlikte, diğer mESC çizgileri ve klonal yalıtır değişken başarı yaşadım. Örneğin, Foxg1::venus mESCs (EB3 kaynaklı; Danjo vd. 13) yanıt kötü bu protokolü ve Foxg1 indüksiyon DD12 tarafından genellikle sırasına % 1-2 olur. Tam olarak anlamıyorum nedeniyle, aynı anda (JQ27 denir) Bu protokol için açıklanan satır olarak izole edildi (JQ59 denir) başka bir Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu protokolü geliştirmeye yardımcı erken çalışmaları için Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP çift muhabir mESC çizgi gibi Jennifer Tyson, Asif Maroof ve Tim Petros geliştirmek için Qing Xu için minnettarız. Biz de CHOP Akış Sitometresi çekirdek teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bir NIH R01 MH066912 (SA) ve F30 MH105045-02 (DT) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
check_url/56358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image