Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en précurseurs des interneurones corticaux
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour générer des progéniteurs interneurones corticaux et des interneurones post-mitotiques précurseurs de cellules souches embryonnaires de souris à l’aide d’une méthode modifiée de corps-à-monocouche embryoïdes. Ces cellules souches/précurseurs peuvent être utilisés in vitro fluorescent triés et transplantés dans le néocortex néonatal pour l’étude de détermination de sort ou utilisés dans des applications thérapeutiques.
Abstract
Les corticales interneurones GABAergiques sont une population hétérogène de cellules qui jouent un rôle crucial en réglementant la production de neurones pyramidaux excitatrices mais aussi de synchroniser les sorties des ensembles de neurones pyramidaux. Les déficits en fonction d’interneurones ont été impliqués dans une variété de troubles neuropsychiatriques, y compris la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La dérivation des interneurones corticaux de cellules souches embryonnaires permet non seulement pour l’étude de leur développement et leur fonction, mais donne un aperçu sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie des affections interneurones corticale. Interneurones ont également la capacité remarquable de survivre, migrer et intégrer dans hôte des circuits corticaux après la transplantation, rendant les candidats idéaux pour une utilisation dans les thérapies cellulaires. Nous présentons ici une méthode monocouche-à-corps embryoïdes évolutive, hautement efficace, mis à jour le pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). En utilisant une ligne de mESC journaliste double Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolé par cellule activée par fluorescence triant (FACS) et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. Nous fournissons également des méthodes pour enrichir pour la parvalbumine (PV) ou de la somatostatine sous-groupes d’interneurones (SST), qui peut être utile pour l’étude des aspects de la détermination du sort ou pour une utilisation dans des applications thérapeutiques qui pourraient bénéficier d’interneurones enrichie en sous-groupe transplantations d’organes.
Introduction
Chez les souris et les humains, environ la moitié des interneurones inhibiteurs tout corticales (CIns) sont créés dans une structure sous-corticale transitoire appelée l’éminence ganglionnaire médial (MGE), où les progéniteurs neuroépithéliales CIns et autres neuronales et gliales sous-groupes d’exprimer le facteur de transcription Nkx2.11,2. Sous-groupes de CIn ou sous-types sont définis par intersection morphologiques, neurochimiques, électrophysiologique et connectivité caractéristiques3,4. Les CIns MGE-dérivés peuvent être regroupés en sous-groupes pour la plupart non-cumul basé sur leur expression de PV ou de SST, l’expression de qui est en corrélation avec notamment électrophysiologiques et connectivité tendances5. Dysfonctionnement des interneurones, surtout dans le sous-groupe de PV, a été impliqué dans plusieurs neuropsychiatriques troubles et maladies6,7. L’objectif général de cette méthode est de produire des cellules souches dérivées de cellules souches mitotiques et migrateurs précurseurs enrichis pour PV ou SST CIn sort pour étudier la biologie des interneurones corticaux et pour utilisation dans les thérapies à base cellulaire.
Nous avons développé une méthode évolutive et très efficace pour la dérivation des progéniteurs d’interneurones exprimant Nkx2.1 et leur progéniture de mESCs. À l’aide d’un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP double journaliste mESC line8, progéniteurs Nkx2.1 ou leur progéniture post-mitotiques exprimant le Lhx6 peut être isolées par l’intermédiaire de FACS et par la suite utilisé dans un certain nombre d’applications en aval. En manipulant un certain nombre de voies de signalisation, de la durée de la culture et le mode de la neurogenèse, nous pouvons obtenir des millions de précurseurs interneurone fluorescent étiquetés convenant à une multitude d’applications en aval.
Bien que plusieurs autres méthodes existent pour générer des progéniteurs MGE-like du mESCs9,10,11,12,13,14, notre méthode, qui repose sur la voie Wnt antagoniste de XAV-939, est particulièrement efficace de générer des Foxg1/Nkx2.1 exprimant des progéniteurs télencéphaliques. En outre, la possibilité de sélectionner des progéniteurs interneurone ou leur progéniture exprimant le Lhx6 post-mitotiques via notre système de double Rapporteur, améliore grandement la capacité de générer des cellules souches distinctes et leur progéniture.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que cette méthode est très efficace pour le patterning mESCs dérivé de J1 (CPCR-1010), nous avons connu un succès variable avec d’autres lignes de la mescaline et isolats clonales. Par exemple, Foxg1::venus mESCs (dérivés EB3 ; Danjo et al. 13) répondent mal au présent protocole et l’induction de la Foxg1 par DD12 est typiquement sur l’ordre de 1 à 2 %. Pour des raisons que nous ne comprenons pas entièrement, clone de journaliste double un autre Nkx2.1::mCherry:Lhx…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Qing Xu pour développer le Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP double journaliste mESC ligne ainsi que Jennifer Tyson, Asif Maroof et Tim Petros pour leur premiers travaux sur les façons d’élaborer ce protocole. Nous remercions également le noyau de cytométrie de flux CHOP pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 MH066912 (SA) et F30 MH105045-02 (DT).
Materials
| Bottle-top vacuum filter system | Corning | CLS430769 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37 |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Do not filter with base media — add after filtration |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39 |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11 |
| L-glutamine (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11 |
| Tissue culture treated dish (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Non-adherent sterile petri dish (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Leukemia inhibitory factor (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0.1% Gelatin Solution | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11 |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| Smoothened agonist (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated | EMD Millipore | 539624 | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
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