سامسونج بوراتيد مطاطا الهلاميات المائية كغشاء الطابق السفلي المحاكاة البيولوجية لثنائي خلية ثقافة
Summary
نماذج الثقافة بلير الحالية لا تسمح للدراسات الفنية في المختبر التي تحاكي في فيفو ميكرونفيرونمينتس. استخدام البولي إثيلين غليكول وأسلوب قولبة أكسيد الزنك، يصف هذا البروتوكول وضع الغشاء المحاكاة البيولوجية سامسونج مع تصلب الانضباطي، المسامية، وتكوين البيوكيميائية الذي يحاكي عن كثب في فيفو مصفوفات خارج الخلية.
Abstract
الغشاء هو عنصر حاسم من بليرس الخلوية التي يمكن أن تختلف في صلابة وتكوينها، والهندسة المعمارية والمساميه. الدراسات في المختبر غشائي طلائي بليرس تقليديا يعتمد على نماذج الدعم نفاذية تمكين الثقافة بلير، ولكن يدعم نفاذية محدودة في قدرتها على إجراء نسخ متماثل تنوع البشرية الطابق السفلي الأغشية. على النقيض من ذلك، نماذج المائية التي تتطلب تجميع المواد الكيميائية العالية الانضباطي والسماح لإدخال تعديلات على صلابة المواد وتكوين البيوكيميائية عن طريق إدماج الببتيدات المحاكاة البيولوجية أو البروتينات. ومع ذلك، محدودة نماذج المائية التقليدية في وظيفة لأنهم يفتقرون إلى المسام خلية خلية الاتصالات والوظيفية في المختبر دراسات الهجرة. بالإضافة إلى ذلك، نظراً لسمك الهلاميات المائية التقليدية، تم إدماج المسام التي تمتد على كامل سمك الهلاميات المائية الصعبة. في الدراسة الحالية، ونحن نستخدم الهلاميات المائية poly-(ethylene-glycol) (الربط) وأسلوب قولبة رواية أكسيد الزنك لمعالجة أوجه القصور السابقة من الهلاميات المائية المحاكاة البيولوجية. كنتيجة لذلك، فإننا نقدم المائية سامسونج، مثل الغشاء تسمح ثقافة بيلاييرس الخلوية المتلاقية على سقالة لتخصيص مع أبنية المسام متغير والخواص الميكانيكية والتركيب البيوكيميائية.
Introduction
مصفوفات خارج الخلية (ECM) يشكلون السقالات البروتين التي دعم مرفق خلية وتكون بمثابة حواجز بين أنواع الخلايا متميزة وعنصرا أساسيا في مجمع الأنسجة والأعضاء. على النقيض من النسيج الضام الخلالي، الغشاء الطابق السفلي (بي أم) هو نوع متخصصة لإدارة المحتوى في المؤسسة التي تعمل كحاجز لتقسيم المقصورات الأنسجة عن بعضها البعض. خدمات إدارة المباني سميكة حوالي 100 ميكرون، وذلك السماح للاتصالات المباشرة وغير المباشرة بين الخلايا على جانبي. اثنين من الأمثلة الشائعة من خدمات إدارة المباني هي الأوعية الدموية خدمات إدارة المباني، وجدت في الجدار ميكروفاسكولار بين بيريسيتيس وخلايا بطانية، وخدمات إدارة المباني في مجرى الهواء التي توجد بين الخلايا الظهارية وبطانية. خدمات إدارة المباني تخدم دوراً هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مثل الخلية القطبية، والهجرة، وفي الصحة والمرض. 1 تكوين وصلابة، والهندسة المعمارية، والمساميه لخدمات إدارة المباني تختلف نظم الجهاز لتسهيل الوظائف الفسيولوجية متميزة. على سبيل المثال، المسام BM حاسمة للحفاظ على الاتصالات خلية خلية، نشر جزيء القابلة للذوبان، والهجرة من الخلايا المناعية أثناء التهاب أو بكتيريا أثناء الإصابة. في الخطوط الجوية، تمتد المسام سمك BM، كامل مع أقطار تتراوح بين 0.75 إلى 3.86 ميكرومتر.2
وتكفل طبيعة رقيقة بي أم أنه على الرغم من أن أنواع الخلايا جسديا مفصولة عن بعضها البعض، هو الحفاظ على الاتصالات بين الخلايا عن طريق وساطة paracrine والاتصال مما يشير إلى. وهكذا، اعتمدت الباحثين لدراسة الأمراض البشرية في المختبر، على إدراج دعم نفاذية المسامية للثقافة بليرس الخلوية. 3 هذه النماذج كانت ذات أهمية حاسمة لفهم الاتصالات الخلوية التي تلعب دوراً في الصحة والمرض. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 إدراج دعم نفاذية تلبية المتطلبات الأساسية لفهم كيف يشير إلى خلية خلية ينظم العمليات الفسيولوجية، مثل تجنيد الكريات البيض وتسلل البكتيرية؛ بيد إدراج قيود كبيرة وتفشل لتقليد دعم بيرميابل BM. بشرية عدم إدراج ألواح كل الميكانيكية والكيميائية الحيوية، وبنية مسامية التبسيط لا تقليد هيكل ليفي أن يخلق المسام غير النظامية النموذجية لخدمات إدارة المباني. ولذلك، هناك حاجة متزايدة لنظم الانضباطي الذي يمكن إعادة إنشاء خصائص BM الأصلية التي تؤثر على العمليات الخلوية.
هي ركائز أساس البوليمر مرشحا مثاليا لتطوير خدمات إدارة المباني لدراسة بليرس الخلوية في إطار أوثق يحاكي البيئة في فيفو المحاكاة البيولوجية. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 البوليمرات ميكانيكيا الانضباطي ويمكن تعديلها كيميائيا لدمج المحاكاة البيولوجية ببتيد شظايا. 11 , 12 , 13 بيوينيرت بوليمر البولي إيثيلين جلايكول (شماعة) يمكن استخدامها لتشييد المباني المحاكاة البيولوجية، ومؤخرا عمل مفصلة توليف شماعة حمض ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك (إدارات) الهلام ميكانيكيا الانضباطي مع شبكات المسامية التي تدعم نمو الخلايا وانزيمية الخلية الملتهبة. 14 على الرغم من نشر القائمة على شماعة ركائز قدم نموذج إدارة المحتوى في المؤسسة البشرية أكثر واقعية مما يدعم نفاذية، العديد من هذه النماذج سميكة جداً، مع عمق ميكرومتر تقريبا 775 يحد من القدرة على خلق الثقافات bilayer مع خلية خلية جهات الاتصال. 14
نقدم هنا، على بروتوكول لإنشاء شماعة المستندة إلى البوليمر BM تقليد أن يتغلب على العديد من أوجه قصور التكنولوجيات الثقافة bilayer الخلية الحالية. لقد قمنا بتطوير أسلوب قولبة أكسيد الزنك، وهي مادة تستخدم على نطاق واسع لتصنيع الإنتاج ميكروكريستالاين، ودمج البوليمر أثناء التوليف وكروسلينكينج، الذي يتم إزالته في وقت لاحق وانتقائية من بوليمر الأكبر الناجمة عن ذلك. هذه العملية بإنشاء شبكة مسامية عشوائي، محاكاة شبكة المسام متعرجة والمترابطة للبشرية خدمات إدارة المباني. علاوة على ذلك، يمكن تغيير التسلل عن طريق تغيير حجم وشكل من ميكروكريستالس أكسيد الزنك عن طريق تعديل stoichiometry رد فعل أثناء إنتاج الإبرة. هذه التقنية المتقدمة هنا يخلق المائية سامسونج الذي يحاكي سمك BM. البشرية “أخيرا”، الميكانيكا، والتسلل، ويمكن بسهولة تغيير تكوين هذه الثوابت مثل BM البيوكيميائية لتوليد المكروية الأكثر مشابهة لتلك المشاهدة في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول بالتفصيل هنا أتاح لنا أن خلق المائية شماعة الانضباطي لتكون بمثابة سقالة المحاكاة البيولوجية BM. على وجه التحديد، متفاوتة الأوزان الجزيئية شماعة، استراتيجيات الاقتران الببتيد، وهياكل ميكروكريستالاين أكسيد الزنك أو تركيزات، معامل المرونة، الخصائص الكيميائية الحيوية، وبنية م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر البروفسور بول فإن شرابه والأستاذ كيندوم أوسوجي للأحاديث المدروسة والخبرة علوم المواد. تم توفير التمويل لهذا العمل بالجائزة مبادرة جديدة Dubinsky والمعاهد الوطنية للصحة نيبيب BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
