תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול
Summary
המודלים הנוכחיים של תרבות bilayer אינן מאפשרות לימודים פונקציונלי במבחנה המחקים ויוו microenvironments. שימוש בפוליאתילן גליקול שיטה תבניות תחמוצת אבץ, פרוטוקול זה מתאר את התפתחות קרום המרתף ביונים ודק במיוחד עם נוקשות tunable, נקבוביות, והרכב ביוכימי המחקה באופן הדוק ויוו מטריצה חוץ-תאית.
Abstract
קרום המרתף הוא מרכיב קריטי bilayers הסלולר שעשוי להשתנות נוקשות, קומפוזיציה, אדריכלות, נקבוביות. באופן מסורתי, מחקרים במבחנה של אנדותל-אפיתל bilayers צריכים לסמוך על תמיכה חדיר דגמים המאפשרים bilayer תרבות, אך תומך חדיר מוגבלים ביכולתם לשכפל את המגוון האנושי ממברנות במרתף. לעומת זאת, מודלים הידרוג הדורשים סינתזה הם מאוד tunable וגם מאפשרים שינויים של הקשיחות גשמי והן את ההרכב הביוכימי באמצעות התאגדות של פפטידים ביונים או חלבונים. עם זאת, מודלים מסורתיים הידרוג מוגבלים בפונקציונליות בשל העדר הנקבוביות עבור אנשי קשר תא-תא ולימודי פונקציונלי במבחנה ההעברה. בנוסף, בשל עובי hydrogels המסורתי, התאגדות של הנקבוביות המתפרסים על פני כל עובי hydrogels כבר מאתגר. במחקר הנוכחי, אנו משתמשים hydrogels poly-(ethylene-glycol) (PEG), שיטה תבניות תחמוצת אבץ הרומן לפנות את החסרונות הקודם של hydrogels הביוני. כתוצאה מכך, אנו מציגים הידרוג ודק במיוחד, כמו קרום המרתף המתיר את התרבות של confluent bilayers הסלולר על גרדום להתאמה אישית עם ארכיטקטורות נקבובית משתנה, תכונות מכניות של ההרכב הביוכימי.
Introduction
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מהווים פיגומים חלבון לתמוך התא מצורף, לשמש המחסומים בין סוגי תאים נפרדים, הם מרכיב חיוני של מורכבות רקמות ואיברים. בניגוד בין-תאי רקמת חיבור, קרום המרתף (מוניטור) היא סוג מיוחד של ה-ECM זה משמש כמחסום כדי לחלק את רקמת תאים אחד מהשני. עב מ עבה כ 100 מיקרומטר, ולכן מאפשרים תקשורת ישירים ועקיפים בין התאים משני צדדיו. שתי דוגמאות נפוצות של עב מ עב מ כלי דם, נמצא בקיר microvascular בין pericytes לבין תאי אנדותל, הינם דרכי הנשימה BMs שנמצאו בין תאי אנדותל ואפיתל. עב מ לשמש תפקיד חשוב בוויסות תא בפונקציה, כגון תא קוטביות והעברה, על בריאות ומחלה. 1 הרכב, נוקשות, אדריכלות, ואת נקבוביות BMs משתנה על פני מערכות איברים כדי להקל על פונקציות פיזיולוגיות שונות. לדוגמה, מוניטור הנקבוביות הם קריטיים עבור שמירה על תקשורת, מולקולה מסיסים דיפוזיה, ועבור נדידה של תאים חיסוניים במהלך דלקת או חיידקים במהלך זיהום. את דרכי הנשימה, נקבוביות span עובי ויטביע, מלא עם קטרים ועד 0.75 3.86 מיקרומטר.2
מהות דק ויטביע מבטיחה כי למרות סוגי תאים מופרדים פיזית אחד מהשני, תקשורת המערכת באמצעות paracrine וצור קשר-בתיווך איתות נשמר. לפיכך, ללמוד מחלות אנושיות במבחנה, חוקרים צריכים לסמוך על תמיכה חדיר נקבובי מוסיף את התרבות התאית bilayers. 3 מודלים אלה היו קריטיים להבנת התקשורת הסלולרית ממלאת תפקיד מחלה ובריאות. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 הוספת תמיכה חדיר לספק את הדרישות הבסיסיות בנושא הבנת איך איתות התא-התא מווסת תהליכים פיזיולוגיים, כגון גיוס ליקוציט חדירת חיידקים; עם זאת, התוספות יש מגבלות משמעותיות, להיכשל לחקות תמיכה BM. Permeable האדם מוסיף חוסר tunability מכני וגם הביוכימי, ואת המבנה הנקבובי פשטנית אינה מחקה את מבנה סיבי שיוצר את הנקבוביות לא סדיר אופייני של עב מ. לכן, יש צורך הולך וגדל עבור מערכות tunable יכולים לשחזר את המאפיינים מוניטור יליד להשפיע על תהליכים תאיים.
מצעים מבוסס פולימר הם מועמדים אידיאליים לפיתוח ביונים BMs ללמוד bilayers הסלולר בהקשר המחקה באופן הדוק יותר על הסביבה ויוו . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 פולימרים הם tunable באופן מכני, יכול להיות שונה מבחינה כימית לשלב ביונים פפטיד שברי. 11 , 12 , 13 bioinert פולימר פוליאתילן גליקול (PEG) ניתן להשתמש כדי לבנות ביונים BMs ולאחר עבודה מפורט הסינתזה של ג’לים ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD) פג tunable באופן מכני עם רשתות נקבובי התומכים צמיחת תאים כימוטקסיס תאים דלקתיים. 14 למרות שפורסם מבוססי פג מצעים מסופקים דגם מציאותית יותר של ECM האנושי מאשר תומך חדיר, רבים של מודלים אלה הם עבות במיוחד, עם עומק של מיקרומטר בערך 775 אשר מגביל את היכולת ליצור bilayer תרבויות עם תא-תא אנשי קשר. 14
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקמת פג מבוסס פולימר מוניטור לחקות מתגבר על רבים מן המגבלות הטכנולוגיות תרבות bilayer התא הנוכחי. פיתחנו שיטה תבניות מובהקים תחמוצת אבץ, החומר בשימוש נרחב לייצור של ייצור שעוות, הפולימר במהלך הסינתזה crosslinking, אשר לאחר מכן, באופן סלקטיבי מוסר פולימר וכתוצאה מכך בצובר. תהליך זה יוצר רשת נקבובי אקראי, מחקה נקבובית שקבל ובעלת רשת BMs אנושי. עוד, ניתן לשנות את נקבוביות על-ידי שינוי הגודל והצורה של microcrystals תחמוצת אבץ באמצעות שינוי של סטויכיומטריה התגובה במהלך הייצור המחט. הטכניקה שפותחה כאן יוצרת של הידרוג זגוגית המחקה את העובי של BM. האנושי ולבסוף, המכונאים, את נקבוביות ולא ניתן לשנות את ההרכב הביוכימי של אלה בונה כמו מוניטור בקלות לייצר microenvironment ביותר דומה כי ראיתי ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול מפורט כאן אפשרה לנו ליצור של הידרוג פג tunable לשמש לפיגום ביונים מוניטור. באופן ספציפי, על ידי משקולות בדרגות שונות של מולקולרית פג, אסטרטגיות ההטיה פפטיד, ו מבנים שעוות תחמוצת אבץ או ריכוזי, את הנפח, תכונות ביוכימיות ומבנה הנקבובי של hydrogels יכול להיות שונה, בהתאמה. לגרדום פג ודק במיוח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות פרופסור פול ואן טאסל, פרופסור Chinedum Osuji עבור שיחות מתחשב ומומחיות הנדסת חומרים שלהם. מימון עבור עבודה זו סופקה על ידי פרס יוזמה חדשה דובינסקי נבחרת מוסדות של בריאות NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
