Ультратонких включить эластичное гидрогели как Biomimetic базальной мембраны для двойного клеточные культуры
Summary
Текущие модели культуре бислой не позволяют для функциональных в vitro исследования, которые имитируют в vivo микросреды. С помощью полиэтиленгликоля и метод шаблонов оксид цинка, этот протокол описывает развитие ультратонких biomimetic базальной мембраны с перестраиваемой жесткость, пористость и биохимический состав, который тесно имитирует в естественных условиях внеклеточные матрицы.
Abstract
Базальной мембраны является критически важным компонентом клеточной бислоев, которые могут меняться в жесткости, композиция, архитектуры и пористость. В vitro исследования эндотелия эпителиальных бислоев традиционно полагались на проницаемых поддержка моделей, которые позволили культуре бислой, но проницаемых поддерживает ограничены в их способности копировать разнообразия человеческого подвале мембран. В противоположность этому гидрогеля модели, требующие химического синтеза высоко настраиваемый и позволяют изменения жесткости материала и биохимический состав через включение biomimetic пептидов и белков. Однако традиционных гидрогелевых модели ограничены в функциональности, потому что им не хватает поры для ячеек контактов и функциональных в vitro исследования миграции. Кроме того из-за толщины традиционных гидрогели, включение поры, которые охватывают всю толщину гидрогели был сложным. В настоящем исследовании мы используем poly-(ethylene-glycol) (PEG) гидрогелей и метод шаблонов Роман окись цинка для устранения предыдущих недостатков biomimetic гидрогелей. В результате мы представляем ультратонких, базальной мембраны, как гидрогель, который позволяет культуры вырожденная сотовой бислоев на настраиваемый леску с переменной поры архитектуры, механические свойства и биохимический состав.
Introduction
Внеклеточные матрицы (ECM) составляют леса белка, которые крепления клеток и служить в качестве барьеров между типами отдельных клеток и являются важным компонентом комплекса тканей и органов. В отличие от интерстициальных соединительной ткани базальной мембраны (БМ) — это специализированный тип ECM, который действует как барьер для разделения отсеков ткани друг от друга. СЭЗ толщиной примерно 100 мкм и поэтому позволяют прямые и косвенные связи между ячейками с обеих сторон. Двумя распространенными примерами СЭЗ являются сосудистые СЭЗ, нашли в микрососудистой стене между pericytes и эндотелиальных клеток и сократимость БМС, которые находятся между эндотелия и эпителиальных клеток. СЭЗ играют важную роль в регулировании функции клеток, клеток полярности и миграции, в здоровье и болезни. 1 состав, жесткость, архитектуры и пористость СЭЗ варьируется систем органов для содействия различных физиологических функций. К примеру BM поры имеют решающее значение для поддержания связи ячеек, растворимых молекул диффузии и для миграции иммунных клеток воспаления или бактерий во время инфекции. В дыхательных путях поры охватывают полную толщину BM, диаметром от 0,75 до 3,86 мкм2
Тонкий характер BM гарантирует, что, хотя типы клеток физически отделены друг от друга, межклеточные связи через опосредованной паракринными и контакт сигнализации сохраняется. Таким образом для изучения болезней человека в пробирке, исследователи полагались на пористых проницаемых Поддержка вставки бислоев клеточной культуры. 3 эти модели были критически важное значение для понимания сотовой связи, который играет определенную роль в здоровье и болезни. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 проницаемых Поддержка вставки удовлетворить основные требования для понимания, как ячеек сигнализации регулирует физиологические процессы, такие как набора лейкоцитов и бактериальных проникновения; Однако, вставки имеют значительные ограничения и не имитировать человека BM. Permeable Поддержка вставки не хватает как механических, так и биохимических перестройки, и упрощенным пористая структура не имитировать волокнистая структура, которая создает нерегулярных поры Типичные СЭЗ. Таким образом существует растущая потребность перестраиваемый систем, которые можно воссоздать родной BM свойств, которые влияют клеточных процессов.
На основе полимерной подложки являются идеальными кандидатами для развития biomimetic СЭЗ для изучения клеточных бислоев в контексте, который более тесно имитирует в естественных условиях окружающей среды. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 полимеры механически перестраиваемый и может быть химически изменена для включения biomimetic терпеноидные фрагменты. 11 , 12 , 13 биоинертный полимер полиэтиленгликоля (PEG) может использоваться для создания биомиметических СЭЗ, и недавняя работа подробный синтез механически перестраиваемый PEG аргинин глицин аспарагиновой кислоты (РГД) гели с пористой сетями, которые поддерживают рост клеток и хемотаксис воспалительных клеток. 14 Хотя опубликованные на базе PEG субстратов предусмотрено более реалистичной модели человека ECM чем проницаемых поддерживает, многие из этих моделей являются чрезвычайно толстый, с глубиной приблизительно 775 мкм, что ограничивает возможность создания бислой культур с ячеек Контакты. 14
Здесь мы представляем собой протокол для создания BM имитировать PEG на полимерной основе, которая преодолевает многие из ограничений текущей ячейки бислой культуры технологий. Мы разработали метод шаблонов, который включает в себя оксид цинка, широко используемым материалом для производства микрокристаллической продукции, в полимерной во время синтеза и сшивки, которая впоследствии и выборочно удалить из результате массовых полимер. Этот процесс создает случайный пористых сеть, подражая извилистый и взаимосвязанных поры сети человека СЭЗ. Кроме того пористость может быть изменено путем изменения размера и формы окись цинка микрокристаллов через изменение реакции стехиометрии во время производства иглы. Методика, разработанная здесь создает ультратонких гидрогеля, который имитирует толщина человеческого BM. Наконец, механики, пористость и биохимический состав этих конструкций BM-как легко может быть изменен для создания микроокружения, наиболее Аналогично, видели в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, подробно здесь позволило нам создать перестраиваемый PEG Гидрогель в качестве лески biomimetic BM. В частности, различной молекулярной массой PEG, пептид спряжение стратегии и оксид цинка микрокристаллическая структур или концентрации, упругости, биохимическими свойствами и пористо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить профессор Пол ван кисточкой и профессор Чинедум Osuji за их продуманные диалоги и материаловедения опыт. Финансирование для этой работы было предоставлено Дубинский новая инициатива премии и национальных институтов здравоохранения NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.
Materials
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
