Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine
Summary
Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.
Abstract
Tuberculose (TB) is een ernstige besmettelijke ziekte en de enige beschikbare vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) is veilig en effectief voor de bescherming tegen kinderen ernstige TB meningitis en sommige vormen van gedissemineerde TB, maar er niet in slaagt om te beschermen tegen pulmonaire TB, die de meest voorkomende vorm van de ziekte is. Veelbelovende strategieën ter verbetering van BCG momenteel rekenen op haar transformatie met genen coderend voor immunodominante M. tuberculosis (Mtb)-specifieke antigenen en/of complementeren met genen coderend voor cofactoren die antigeen zou stimuleren presentatie van cellen. Belangrijke beperkingen van deze benaderingen zijn lage efficiëntie, lage stabiliteit en het onzekere veiligheidsniveau van expressievectoren. In deze studie presenteren wij een alternatieve aanpak van vaccin verbetering, die bestaat uit BCG complementeren met exogene proteïnen van belang op het oppervlak van bacteriën, in plaats van transformatie met plasmiden codering van de bijbehorende genen. Eerst, eiwitten van belang worden uitgedrukt in fusie met monomere avidin in standaard E. coli expressiesystemen en vervolgens gebruikt voor het decoreren van het oppervlak van biotinyleerd BCG. Dierproeven met behulp van BCG oppervlak versierd met surrogaat ovoalbumine antigeen aantonen dat het gewijzigde bacterie is volledig immunogeen en specifieke T cel reacties teweeg kunnen. Over het geheel genomen ondersteunen de hier gepresenteerde sterk gegevens een roman en efficiënte methode voor het omvormen van de huidige BCG-vaccin dat de moeizame conventionele benadering van complementatie vervangen door exogene nucleïnezuren.
Introduction
Diverse strategieën zijn voorgesteld ter vervanging van het huidige TB-vaccin BCG, met inbegrip van eiwit adjuvans systemen, virale vectored technologieën, verzwakte levende stammen van de M.tb en genetisch gemodificeerde stammen van de BCG, ofwel invoering van genen over het uitdrukken van BCG-antigenen die niet voldoende blijk tijdens de infectie1 of Mtb gegeven-specifieke antigenen niet aanwezig in de BCG2. Genetische manipulatie, echter geconfronteerd met vele belemmeringen met inbegrip van de onzekere niveau van veiligheid, het tijdrovende proces en het lage rendement van4,5van de vectoren van de expressie. Met betrekking tot de verbetering van de BCG, is een alternatieve aanpak nodig ter verbetering van de immunogeniciteit zonder de noodzaak voor onzekere genetische afwisseling.
In deze studie introduceren wij een nieuwe strategie voor de weergave van recombinante eiwitten van de rente over het celoppervlak BCG, dat is gebaseerd op de interactie van de bekende avidin van hoge-affiniteit met biotine. Deze benadering biedt snelle en reproduceerbare gehechtheid van recombinante avidin fusion eiwitten op het oppervlak van biotinyleerd BCG, dat brede manipulaties van BCG vergemakkelijkt op een maximale verbetering van zijn werkzaamheid met behoud van haar uitstekende veiligheid opnemen, die gedurende tientallen jaren van gebruik.
Avidin affiniteit voor Biotine is extreem hoog (K,d = 1015 M) en eenmaal gevormd, het Biotine-avidin-complex is zeer stabiel en slechts onder voorwaarden6denaturering kan worden verstoord. Echter, voor dit soort interactie om te dienen als een gen alternatief voor de methode van de overdracht, op lange termijn maar omkeerbare weergave van recombinante eiwitten is vereist. Zo introduceerden we hier een lage affiniteit monomeer avidin (K,d = 10−7 M) dat leidt tot de omkeerbare release van eiwit van het oppervlak versierd BCG eenmaal ingenomen binnen antigeen presentatie van cellen. We getest om te voorzien van een proof of concept, deze methode met behulp van een monomeer avidin chimeer eiwit overeenkomt met een surrogaat-antigeen afgeleid van ovoalbumine (OVA)7,8. De resultaten toonden aan dat het celoppervlak BCG kan gemakkelijk en snel met worden verfraaid monomere avidin fusion eiwitten en dat deze binding aan de oppervlakte van de BCG stabiel en reproduceerbare zonder waarneembare veranderingen in de bacteriële groei en overleving is. Ook vonden we dat BCG versierd met monomere avidin gefuseerd met eicellen (AviOVA) kan veroorzaken een immuunrespons die vergelijkbaar is met die geïnduceerd door BCG genetisch uiting te geven aan het zelfde antigeen zowel in vitro als in vivo. Deze technologie van omkeerbare display van eiwitten van de rente over het bacteriële oppervlak is daarom een doeltreffende vervanging van traditionele gene transfer benaderingen en kan een platform bieden voor brede manipulaties van BCG en verdere toepassingen in vaccin ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie meldden wij een niet-genetische aanpak voor snelle en effectieve weergave van exogene eiwitten op BCG oppervlak om toe te voegen specifieke antigenen of specifieke functionele eigenschappen verwacht om efficiënt de immunogeniciteit van de bacterie. We toonden aan dat het celoppervlak BCG biotinyleerd voor ogenblikkelijke oppervlakte decoratie met avidin fusion eiwitten gemakkelijk zou kunnen zijn. De totale procedure kan worden uitgevoerd binnen de 2 uur, terwijl genetische transformatie en selectie van p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. R Stokes voor de BCG Pasteur stam en A. Talal voor technische ondersteuning. Wij danken GenScript voor hulp bij gene synthese.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
