Eksojen antijenleri Mycobacterium bovis BCG aşısı Avidin-biotin sistemi ile sigara genetik yüzey dekorasyon ile ifade
Summary
Bakteriyel bir yüzey hızlı antijen görüntülemek için yeni bir teknik olan yüzey biotinylation proteinler füzyon monomeric avidin ile ilgi maruz takip içerir sunulur. BCG seçili antijenleri ile başarıyla yükleme yüzey dekorasyon geleneksel genetik yaklaşımlar yerine düşündüren onun immünojenisite geliştirir.
Abstract
Tüberküloz (TB) ciddi bir bulaşıcı hastalık ve biricik elde edilebilir aşı M. bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) çocuk şiddetli TB menenjit ve Dissemine TB bazı türlerinin karşı koruma için güvenli ve etkili ama başaramamak-e doğru korumak olduğunu Akciğer TB karşı hangi hastalığın en yaygın biçimidir. Şu anda BCG geliştirmek için umut verici stratejileri ya dönüştürmenin immunodominant M. tuberculosis (Mtb)kodlama genlerimizle itimat-belirli antijenleri ve/veya tamamlayıcı antijen teşvik etkenler kodlama genler ile hücreleri sunulması. Bu yaklaşımlara büyük sınırlamalar düşük verimlilik, düşük istikrar ve güvenliğini ifade vektörel çizimler belirsiz düzeyini içerir. Bu çalışmada, BCG uluslara bakteri, tercihan–dan dönüştürme yüzeyinde ilgi eksojen proteinler ile ilgili genlerin kodlama Plasmid’ler ile oluşur aşı geliştirme için alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. İlk olarak, proteinler ilgi erime içinde standart E. coli monomeric avidin ile ifade edilir ifade sistemleri ve biotinylated BCG yüzeyine süslemek için kullandı. Hayvan deneyleri BCG yüzey yedek ovalbumin antijen ile dekore edilmiş kullanarak değiştirilmiş bakteri tamamen immunojenik ve belirli T hücre yanıt ikna yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Tamamen, kesinlikle burada sunulan veri uluslara zahmetli geleneksel yaklaşım eksojen nükleik asitler ile değiştirir geçerli BCG aşısı yeniden şekillendirilmesi için bir roman ve verimli yöntem destekler.
Introduction
Çeşitli stratejileri geçerli TB aşı BCG protein adjuvan sistemleri, viral vektörlü teknolojileri, zayıflatılmış canlı M.tb suşları ve genetiği değiştirilmiş BCG suşları, ya genlerinin tanıtmak için de dahil olmak üzere, eski yerine koymak için önerilen yeterince enfeksiyon1 ya da Mtbsırasında gösterilir değil BCG antijenleri aşırı ifade-belirli antijenleri BCG2‘ mevcut değil. Genetik mühendisliği, ancak, birçok engeller Emanet, zaman alan işlem ve düşük verimlilik ifade vektörel çizimler4,5belirsiz düzey de dahil olmak üzere karşı karşıya. BCG iyileştirilmesi açısından, alternatif bir yaklaşım immünojenisite belirsiz genetik değişiklikler için gerek kalmadan geliştirmek için gereklidir.
Bu çalışmada, biotin tanınmış yüksek afinite avidin etkileşim dayanır BCG hücre yüzeyi ilgi rekombinant proteinlerin görüntü için yeni bir strateji tanıtmak. Bu yaklaşım hızlı ve tekrarlanabilir eki rekombinant avidin füzyon proteinlerin biotinylated maksimal iyileştirme onun etkinliğinin onun mükemmel emniyet koruyarak ulaşmak için BCG geniş işlemler kolaylaştırır BCG yüzeyi sağlar kayıt, kullanım yılda gözlenen.
Biotin için avidin ilgi son derece yüksektir (Kd 10−15 M =) ve bir kez kurulan, biotin avidin karmaşık çok kararlı ve yalnızca koşullar6denaturing altında bozulmuş. Ancak, bu tür bir gen transferi yöntemi alternatif olarak hizmet için etkileşim için uzun vadeli ama geri döndürülebilir ekran rekombinant proteinlerin gereklidir. Böylece, biz burada bir düşük benzeşme monomeric avidin tanıttı (Kd 10−7 M =) protein tersinir sürümü götürür yüzey hücreleri sunulması antijen içinde bir kez yutulur BCG dekore edilmiştir. Kavramının bir kanıtı olarak sağlamak için bu yöntem ovalbumin (OVA)7,8‘ den türetilmiş bir vekil antijen karşılık gelen bir monomeric avidin chimeric protein kullanarak test ettik. BCG hücre yüzeyine kolayca ve hızla monomeric avidin füzyon proteinler ile dekore edilebilir olduğunu ve bu bağlama BCG yüzeye istikrarlı ve bakteriyel büyüme ve hayatta kalma tespit değişiklikler olmadan tekrarlanabilir sonuçlar gösterdi. Ayrıca, monomeric avidin OVA (AviOVA) ile erimiş süslenmiş BCG BCG tarafından indüklenen için benzer bir bağışıklık yanıtı tetikleyebilir genetik olarak aynı antijen ifade bulduk vitro ve içinde vivo. Bu teknoloji bakteri yüzeyindeki ilgi proteinlerin geri döndürülebilir ekran bu nedenle geleneksel gen transferi yaklaşımlar etkili bir yerini ve BCG geniş işlemler ve daha fazla aşı uygulamaları için bir platform sağlayabilir geliştirme.
Protocol
Representative Results
Discussion
BCG yüzeyinde belirli antijenleri veya bakteri’nın immünojenisite verimli bir şekilde geliştirmek için beklenen belirli fonksiyonel özellikler eklemek için hızlı ve etkili görüntü eksojen proteinlerin için genetik olmayan bir yaklaşım bu çalışmada bildirdi. BCG hücre yüzeyine kolayca biotinylated avidin füzyon protein ile anlık yüzey dekorasyon için olabilir gösterdi. Genetik dönüşümü ve olumlu klonlar yelpazesi gerektirir iken 2-3 ay zaman lag toplam yordam içinde 2 h, gerçekleştirilebi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr R Stokes BCG Pasteur zorlanma için ve A. Talal teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca GenScript gen sentezi ile yardım için teşekkür.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
