Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina
Summary
Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.
Abstract
Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa grave e o bacilo da vacina disponível apenas M. bovis Calmette-Guérin (BCG) é segura e eficaz para proteção contra meningite de TB infantil grave e algumas formas de tuberculose disseminada, mas não consegue proteger contra a tuberculose pulmonar, que é a forma mais prevalente da doença. Promissoras para melhorar BCG atualmente confiam na sua transformação com genes que codificam imunodominantes M. tuberculosis (Mtb)-antígenos específicos e/ou complementação com genes que codificam co-fatores que estimulam o antígeno apresentação de células. Maiores limitações para essas abordagens incluem baixa eficiência e baixa estabilidade do nível incerto de segurança de vetores de expressão. Neste estudo, apresentamos uma abordagem alternativa para melhoria da vacina, que consiste de complementação do BCG com proteínas exógenas de interesse na superfície de bactérias, ao invés de transformação com plasmídeos codificação de genes correspondentes. Primeiro, as proteínas de interesse são expressos em fusão com avidin monomérico em padrão Escherichia coli sistemas de expressão e, em seguida, usado para decorar a superfície de biotinilado BCG. Usando a superfície de BCG decorado com antígeno de ovalbumina substituto das experiências com animais demonstram que a bactéria modificada é totalmente imunogênicas e capazes de induzir respostas de célula T específica. No total, os dados aqui apresentados fortemente apoiar um romance e um método eficiente para remodelar a vacina BCG atual que substitui a abordagem convencional laboriosa de complementação com os ácidos nucleicos exógenos.
Introduction
Várias estratégias têm sido propostas para substituir a atual vacina contra tuberculose BCG, incluindo sistemas de adjuvante da proteína, tecnologias em vetor virais, M.tb cepas atenuadas e cepas de BCG geneticamente modificadas, também para introduzir genes excesso, expressando antígenos de BCG que não são suficientemente expressa durante infecção1 ou Mtb-antígenos específicos, não presentes na BCG2. Engenharia genética, no entanto, enfrenta muitos obstáculos, incluindo o nível incerto de segurança, o processo demorado e a baixa eficiência de expressão vetores4,5. Com relação à melhoria da BCG, uma abordagem alternativa é necessário para melhorar a imunogenicidade sem a necessidade de alternações genéticas incertas.
Neste estudo, apresentamos uma estratégia romance para exibição de proteínas recombinantes de interesse na superfície das células de BCG que baseia-se na interação conhecida avidin alta afinidade com biotina. Esta abordagem permite fixação rápida e reprodutível de proteínas recombinantes avidin da fusão na superfície do biotinilado BCG, o que facilita o amplas manipulações de BCG para alcançar a máxima melhoria da sua eficácia, mantendo sua segurança excelente grave, observada ao longo de décadas de uso.
Afinidade avidina biotina é extremamente alta (Kd = 10−15 M) e uma vez formado, o complexo biotina-avidina é muito estável e pode ser interrompido somente sob condições6de desnaturação. No entanto, para este tipo de interação para servir como uma alternativa de método de transferência genética, exposição a longo prazo mas reversível das proteínas recombinantes é necessária. Assim, apresentamos aqui uma avidina monomérica de baixa afinidade (Kd = 10−7 M) que leva à liberação reversível de proteína da superfície decorada BCG, uma vez ingerido dentro de células apresentadoras. A fim de fornecer uma prova de conceito, nós testamos esse método usando uma proteína quimérico avidin monomérico, correspondente a um antígeno substituto derivado de ovalbumina (OVA)7,8. Os resultados mostraram que a superfície da célula BCG pode ser facilmente e rapidamente decorada com proteínas da fusão avidin monoméricos e que essa ligação à superfície de BCG é estável e pode ser reproduzido sem alterações detectáveis no crescimento bacteriano e sobrevivência. Além disso, encontramos que a BCG decorado com avidin monomérico fundida com óvulos (AviOVA) pode induzir uma resposta imune semelhante àquela induzida por BCG geneticamente expressando o mesmo antígeno tanto in vitro e in vivo. Esta tecnologia de display reversível das proteínas de interesse na superfície bacteriana é, portanto, um substituto eficaz das abordagens de transferência do gene tradicional e pode fornecer uma plataforma para grandes manipulações de BCG e outras aplicações em vacina desenvolvimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós relatamos neste estudo uma abordagem não-genético para exibição rápida e eficaz de proteínas exógenas na superfície de BCG para adicionar propriedades funcionais específicas eficientemente melhore imunogenicidade da bactéria ou antígenos específicos. Demonstrámos que superfície celular BCG pode ser facilmente biotinilado para decoração de superfície instantânea com proteínas da fusão avidina. O procedimento total pode ser realizado até 2 horas, enquanto transformação genética e seleção de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Dr. R Stokes para a cepa BCG Pasteur e r. Talal para suporte técnico. Agradecemos também o GenScript para obter ajuda com a síntese do gene.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
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