מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans
Summary
פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.
Abstract
הערכה רעילות חיוני להבנת השפעת כימיקלים על היצורים החיים בתחומים במדעי הביולוגיה בסיסי ויישומי. קרקע ללא מידע יונקים עגול תולעת, Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל ערך מחקרים הרעלים בשל הנוחות שלה חוסר סוגיות אתיקה בעלי חיים לעומת מערכות בעלי חיים יונקים. ב פרוטוקול זה, מתואר הליך מפורט הערכה רעילות של כימיקלים C . elegans. תרופה נגד סרטן קליני, etoposide, אשר מטרות טופואיזומראז האדם השני, מעכב שכפול ה-DNA של תאים סרטניים אנושיים, נבחרה כמודל בדיקה כימית. גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים נחשפו דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או etoposide ולאחר מכן הצמיחה של C. elegans נוטרה כל יום במשך 4 ימים על ידי התצפית סטריאו מיקרוסקופ. המספר הכולל של ביצים זיון של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide נספר גם באמצעות המיקרוסקופ סטריאו. טיפול Etoposide מושפע באופן משמעותי את הצמיחה ואת רבייה של C. elegans. על ידי השוואה של המספר הכולל של ביצים זיון של תולעים עם טיפול שונה תקופות של כימיקלים, אפשר לפתור אותה כי הרבייה רעילות של כימיקלים על רבייה C. elegans הוא הפיך או בלתי הפיך. פרוטוקולים אלה עשוי להיות שימושי עבור שני בפיתוח של תרופות שונות, הערכת סיכונים של חשיפה לרעלים סביבתיים.
Introduction
הערכה רעילות חיוני עבור הפיתוח של תרופות, בריאותיים, cosmeceuticals, כמו גם את הערכת הסיכונים של רעלנים סביבתיים שונים. המודל מכרסמים הוא אחת ממערכות הפופולרי ביותר ויוו ניסיוני במחקר זה רעלים; לחלופין, ללא מידע יונקים אורגניזמים כגון C. elegans גם בשימוש נרחב. מודלים להערכה רעילות Non-מידע יונקים מועילים בגלל לא רק בעלי חיים סוגיות אתיות אבל גם שמתאים להם והתועלת בהתחשב משתלמת, לתחזוקה בקלות שמאפשר, מהירות ואת הפארמצבטית1,2 3, ,4.
C. elegans, קרקע סביב התולעת נוצלה כחיה מודל בחקר ביולוגיה וכימיה בסיסי ויישומי שונים. . זה באורך של 1 מ מ, תולעים נימיות שקוף, אשר פשוט נשמר ב מוצק או נוזלי תולעים נימיות צמיחה מדיה (NGM) נמאס את הנבג החיידק Escherichia coli OP50 C. elegans יש מחזור חיים קצר, והוא N2 פראי-סוג C. elegans מטילה כ 300 ביצים. לכן, זה בקלות הופץ כדי לשמש חומרים ניסיוניים3,4,5. C. elegans גם כבר בשימוש נרחב במחקרים רעילות של הרבה סמים, מזהמים סביבתיים6,7,8,9.
משום תרופות נגד סרטן רבות למקד במהירות חלוקת תאים סרטניים, הם יכולים גם לפגוע במהירות חלוקת תאים נורמליים כגון מח העצם, אפיתל המעי, התאים זקיק השיער. לדוגמה, תרופות מעכבות טופואיזומראז למקד את תהליך שכפול ה-DNA של תאים סרטניים; לכן, גם מונעים במהירות חלוקת תאים נורמליים. כל היצורים החיים יש topoisomerases, אלה טופואיזומראז מעכבי ככל הנראה השפעה סביבתיות אקולוגיות6,10,11. לכן, פלטפורמה הערכה רעילות התרופה באמצעות חיית מודל הוא יקר עבור שניהם הפיתוח של תרופות ושל הערכת סיכונים סביבתיים.
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לבדוק הרעילות של etoposide, אשר הוא סוכן נגד סרטן קליני הזה טופואיזומראז מטרות II, כמו כימי רעיל דגם C. elegans. לענין זה, נתאר את שיטת המדידה לגודל הגוף ואת המספר הכולל של ביצים זיון ב- C. elegans שטופלו etoposide.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, אנו מתארים את ההערכה רעילות של כימיקלים ב- C. elegans, נמטודות, באמצעות etoposide כדוגמה toxicant. למטרה זו, השתמשנו בשני תנאים ניסיוני. במערכה הראשונה, C. elegans גדלו על etoposide המכיל לוחות מביצים על הבמה למבוגרים צעירים, ואז התולעים הורשו להטיל ביצים על צלחות NGM רגילה ללא כימיקלים. במערכה ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי את קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה מחקר מגזר גרנט (2E27513), את גבוהה ערך מוסף מזון טכנולוגיה פיתוח התוכנית (IPET) ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון לענייני כפרי (315067-03).
Materials
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
