Измерение воздействия химических веществ на рост и размножение Caenorhabditis elegans
Summary
Основной протокол для оценки токсичности химических веществ в модель животного, Caenorhabditis elegans, описан. Метод является удобным и полезным для развития фармацевтических препаратов, а также для оценки риска различных загрязнителей окружающей среды.
Abstract
Токсикологические оценки имеет решающее значение для понимания воздействия химических веществ на живые организмы в фундаментальных и прикладных биологических наук. Не млекопитающих почвы круглый червь, Caenorhabditis elegans, является ценным модельный организм для токсикологических исследований из-за его удобства и отсутствие животных этики вопросов по сравнению с системами, млекопитающих животных. В этом протоколе описывается подробная процедура токсикологической оценке химических веществ в C. elegans . Противоопухолевых лекарств, этопозид, который предназначен для человека топоизомеразы II и подавляет репликацию ДНК человеческих раковых клеток, был выбран в качестве модели тестирования химической. Возраст синхронизированы C. elegans яйца были подвержены диметилсульфоксида (ДМСО) или этопозид, а затем рост C. elegans контролируется каждый день в течение 4 дней наблюдения стерео Микроскоп. Общее количество яиц проложен от C. elegans относились с ДМСО или этопозид также учитываются с помощью стерео Микроскоп. Этопозид лечения существенно повлияло на рост и воспроизводство C. elegans. Для сравнения из общего числа яиц от червей с периодами лечения различных химических веществ, может решил, что репродуктивная токсичность химических веществ на воспроизведение C. elegans является обратимым или необратимым. Эти протоколы могут быть полезны для разработки различных наркотиков и оценки риска экологических токсикантов.
Introduction
Токсикологическая оценка имеет важное значение для развития фармацевтических препаратов, пищевых добавок, и космецевтики, а также оценке риска различных экологических токсинов. Грызун модель является одним из самых популярных в естественных условиях экспериментальных систем для этого исследования токсикологии; Кроме того также широко используются организмов не млекопитающих, таких как C. elegans . Non млекопитающих токсикологической оценке модели являются полезными ввиду не только животных этические вопросы, но и их удобство и полезность рассмотрения эффективности затрат, ремонтопригодность, скорость и воспроизводимость1,2 ,3,4.
C. elegans, почвы круглый червь, была использована как модель животных в различных фундаментальные и прикладные исследования по биологии и химии. Это 1 мм длиной, прозрачный нематода, который просто ведется в твердом или жидком нематода роста СМИ (НГМ) кормили с бактериальный штамм кишечной палочки ОР50. C. elegans имеет короткий жизненный цикл, и одичал тип N2 C. elegans откладывает примерно 300 яиц. Таким образом он легко размножается использоваться как экспериментальные материалы3,4,5. C. elegans также широко используется в токсикологических исследованиях многих лекарств и загрязняющих окружающую среду6,,78,9.
Потому что многие противораковые препараты целевых быстро делящиеся раковые клетки, они также могут повредить быстро делящихся нормальные клетки костного мозга, кишечного эпителия и клеток волосяного фолликула. Например тормозящий противораковые препараты топоизомеразы целевой процесс репликации ДНК раковых клеток; Таким образом они также тормозят, быстро делящихся нормальные клетки. Каждый живой организм имеет топоизомеразы и эти топоизомеразы ингибиторы скорее воздействия окружающей среды экосистем6,10,11. Таким образом платформа токсикологической оценке наркотиков, используя модель животного является ценным для развития фармацевтики и оценки экологических рисков.
В этой статье мы опишем подробные протоколы для проверки на токсичность этопозид, которая является клинической противораковый агент что цели топоизомеразы II, как модель токсичных химических веществ в C. elegans. Для этой цели мы будем описывать метод измерения размеров тела и общее количество яиц в C. elegans относились с Этопозид.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы опишем оценки токсичности химических веществ в C. elegans, почвенных нематод, используя этопозид токсиканта примером. Для этой цели мы использовали два экспериментальных условиях. В первом наборе C. elegans были выращены на этопозид, содержащие пластины от яйца до ста?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано интрамуральных исследовательский грант Корейский институт науки и технологии (2E27513) и высокую добавленную стоимость продовольственной технологии развития программы (IPET) финансируется министерством сельского хозяйства, продовольствия и сельских дел (315067-03).
Materials
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
