Måle effekten av kjemikalier på vekst og reproduksjon av Caenorhabditis elegans
Summary
En grunnleggende protokoll vurdere toksisitet av kjemikalier i en modell dyr, Caenorhabditis elegans, er beskrevet. Metoden er praktisk og nyttig for utviklingen av legemidler så vel som for risikovurdering av forskjellige miljøgifter.
Abstract
Toksikologiske evaluering er avgjørende for å forstå effekten av kjemikalier på levende organismer i grunnleggende og anvendt biologiske vitenskap felt. En ikke-pattedyr jord rundt ormen, Caenorhabditis elegans, er en verdifull modell organisme for toksikologi studier på grunn av sin bekvemmelighet og mangel på dyreetikk problemer sammenlignet med pattedyr dyr systemer. En detaljert prosedyre av toksikologiske evaluering av kjemikalier i C. elegans er beskrevet i denne protokollen. En klinisk anticancer narkotika, etoposide, som mål menneskelige topoisomerase II og hemmer utryddelse av menneskelig kreftceller, ble valgt som modell testing kjemisk. Alder-synkroniserte C. elegans egg ble utsatt for dimethyl sulfoxide (DMSO) eller etoposide, og deretter vekst C. elegans var overvåkes hver dag i 4 dager av stereo mikroskop observasjon. Totalt antall egg lagt fra C. elegans behandlet med DMSO eller etoposide regnes også ved hjelp av stereo mikroskopet. Etoposide behandling i betydelig grad påvirket vekst og reproduksjon C.elegans. Sammenligning av antall egg lagt fra ormer med forskjellige treatment perioder av kjemikalier, kan det være bestemt at reproduktivtoksisitetsstudier av kjemikalier på C. elegans reproduksjon er reversibel eller irreversible. Disse protokollene kan være nyttig for både utviklingen av ulike stoffer og risikovurdering av miljømessige giftstoffer.
Introduction
Toksikologiske evaluering er viktig for utviklingen av legemidler, nutraceuticals, og cosmeceuticals, samt risikovurdering av forskjellige miljøgifter. Gnager modellen er en av de mest populære i vivo eksperimentelle systemene for denne undersøkelse; også er ikke-pattedyr organismer som C. elegans også mye brukt. Non-pattedyr toksikologiske evaluering modeller er gunstig på grunn av ikke bare dyr etiske spørsmål, men også deres bekvemmelighet og nytte vurderer kostnadseffektivitet, maintainability, hastighet og reproduserbarhet1,2 ,3,4.
C. elegans, en jord rundt ormen, har blitt utnyttet som en modell dyr i ulike grunnleggende anvendt biologi og kjemi forskning. Det er en 1 mm lang, gjennomsiktig nematode, som bare er vedlikeholdt i fast eller flytende Rundormer vekst medier (NGM) med bakterielle belastningen Escherichia coli OP50. C. elegans har en kort livssyklus, og vill-type N2 C. elegans ligger ca 300 eggeskall. Derfor overføres det lett brukes som experimental materialer3,4,5. C. elegans har også vært mye brukt i toksikologiske undersøkelsene av mange narkotika og miljøgifter6,7,8,9.
Fordi mange anticancer legemidler målet raskt dele celler, kan de også skade raskt dele normale celler som benmargen, intestinal epitel og hårsekken celler. For eksempel målrette topoisomerase hemmende anticancer narkotika DNA replikeringsprosessen med kreftceller. Derfor hemmer de også raskt dele normale celler. Hver levende organisme har topoisomerases og disse topoisomerase hemmere sannsynligvis innvirkning miljømessige økosystemer6,10,11. Dermed er en narkotika toksikologiske evaluering plattform ved hjelp av en modell dyr verdifulle for både utviklingen av legemidler og risikovurdering.
I denne artikkelen beskriver vi detaljerte protokoller for å teste toksisitet av etoposide, som er en klinisk anticancer agent som mål topoisomerase II, som en modell giftig kjemisk i C. elegans. For dette formålet, vil vi beskrive metoden måling kroppsstørrelse og antall egg lagt i C. elegans behandlet med etoposide.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen beskrive vi toksisitet evalueringen av kjemikalier i C. elegans, en jord-nematode, med etoposide som et toxicant eksempel. For dette formålet brukte vi to eksperimentelle forhold. I det første settet, C. elegans ble dyrket på etoposide som inneholder plater fra egg til ung voksen scenen og deretter ormene fikk lov til å legge egg på normal NGM plater uten kjemikalier. I andre eksperimentelle sett, ble C. elegans kontinuerlig behandlet med etoposide gjennom hele eksperime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Korea Institute of Science and Technology intramural forskning tilskudd (2E27513) og det høy verdiøkende mat teknologi Development Program (IPET) finansiert av Landbruksdepartementet, Food and Rural Affairs (315067-03).
Materials
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
