Mäta effekten av kemikalier på tillväxt och reproduktion av Caenorhabditis elegans
Summary
En grundläggande protokollet att utvärdera toxiciteten av kemikalier i en modell djur, Caenorhabditis elegans, beskrivs. Metoden är bekvämt och praktiskt för utveckling av läkemedel samt för riskbedömning av olika miljöföroreningar.
Abstract
Toxikologisk utvärdering är avgörande för att förstå effekterna av kemikalier på levande organismer i grundforskning och tillämpad biologisk vetenskap fält. En icke däggdjur jord runt masken Caenorhabditis elegans, är värdefulla modellorganism för toxikologiska studier på grund av dess bekvämlighet och djuretik problem jämfört med däggdjur djur system. I detta protokoll beskrivs ett detaljerat förfarande av toxikologiska utvärdering av kemikalier i C. elegans . En klinisk cancer drog, etoposid, som riktar sig till mänsklig topoisomeras II och hämmar DNA-replikation av mänskliga cancerceller, valdes som modell testning kemiska. Ålder-synkroniserad C. elegans ägg utsattes för antingen dimetyl sulfoxid (DMSO) eller etoposid och då tillväxten av C. elegans var övervakas varje dag i 4 dagar av stereo Mikroskop observationen. Totala antalet ägg som från C. elegans behandlas med DMSO eller etoposid räknades också med hjälp av stereomikroskopet. Etoposid behandling påverkas signifikant tillväxt och reproduktion av C. elegans. Genom jämförelse av totala antalet ägg som från maskar med olika behandlingsperioder av kemikalier, kan det beslutas att reproduktiv toxicitet av kemikalier på C. elegans reproduktionen är reversibel eller irreversibel. Dessa protokoll kan vara till hjälp för både utvecklingen av olika droger och riskbedömning av miljögifter.
Introduction
Toxikologisk utvärdering är avgörande för utvecklingen av läkemedel, nutraceuticals, och cosmeceuticals, samt riskbedömningen av olika miljögifter. Gnagare modellen är en av de mest populära i vivo experimentella system för toxikologi studien; Alternativt används också allmänt icke däggdjur organismer såsom C. elegans . Icke-däggdjur toxikologisk utvärdering modeller är fördelaktigt på grund av inte bara djur etiska frågor utan också deras bekvämlighet och nyttan med tanke på kostnadseffektivitet, underhållsmässighet, hastighet och reproducerbarhet1,2 ,3,4.
C. elegans, en jord runt mask, har utnyttjats som ett modell djur i olika grundläggande och tillämpad biologi och kemi forskning. Det är en 1 mm långa, genomskinliga nematod, som helt enkelt upprätthålls i fast eller flytande Nematoden Growth Media (NGM) matas med bakteriell stam Escherichia coli OP50. C. elegans har kort livslängd och vildtyps-N2 C. elegans lägger cirka 300 ägg. Därför är det lätt förökas för att användas som experimentella material3,4,5. C. elegans har också använts i de toxikologiska studierna av många läkemedel och miljögifter6,7,8,9.
Eftersom många cytostatika mål snabbt delande cancerceller, kan de också skada snabbt delande normala celler såsom benmärg, intestinal epitel och hårsäcken celler. Till exempel rikta topoisomeras hämmande cytostatika DNA replikeringen av cancerceller; Därför, de hämmar också snabbt delande normala celler. Varje levande organism har topoisomeraser, och dessa topoisomeras hämmare mest sannolika inverkan miljömässiga ekosystem6,10,11. En drog toxikologisk utvärdering plattform med hjälp av en modell djur är alltså värdefullt för både utvecklingen av läkemedel och miljöriskbedömning.
I den här artikeln beskriver vi de detaljerade protokoll för att testa toxiciteten av etoposid, som är en klinisk cancer agent att mål topoisomeras II, som en modell miljögift i C. elegans. För detta ändamål kommer vi att beskriva mätmetoden av kroppsstorlek och det totala antalet ägg som i C. elegans behandlas med etoposid.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln beskriver vi toxicitet utvärdering av kemikalier i C. elegans, en jord nematod, med etoposid som en toxiska exempel. För detta ändamål använde vi två experimentella förhållanden. C. elegans har odlats på etoposid som innehåller plattor från ägg till unga vuxna scenen i första set, och sedan tilläts maskarna lägger ägg på normala NGM plattor utan kemikalier. I den andra experimentella uppsättningen behandlades kontinuerligt C. elegans med etoposid under hela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Korea Institute of Science och Technology intramurala forskning bidraget (2E27513) och höga moms mat teknik utveckling Program (IPET) finansieras av Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).
Materials
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
