पूरे माउंट समाशोधन और Arabidopsis फूल अंगों और Siliques के दाग
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम Arabidopsis फूल और siliques के समुचित विच्छेदन के लिए तकनीक का वर्णन, कुछ बुनियादी समाशोधन तकनीक, और चयनित पूरी-प्रजनन संरचनाओं के प्रेक्षण माउंट के लिए प्रक्रियाओं धुंधला ।
Abstract
आणविक आनुवंशिक अध्ययन के लिए अपनी दुर्जेय उपकरण के कारण, Arabidopsis थालियाना संयंत्र जीव विज्ञान में सबसे प्रमुख मॉडल प्रजातियों में से एक है और, विशेष रूप से, संयंत्र प्रजनन जीव विज्ञान में । हालांकि, संयंत्र रूपात्मक, संरचनात्मक, और ultrastructural विश्लेषण पारंपरिक रूप से समय लेने वाली embedding और चमकदार क्षेत्र, स्कैनिंग, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रक्रियाओं की धारा शामिल है । फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में हाल ही में प्रगति, राज्य के अत्याधुनिक 3-डी कंप्यूटर सूक्ष्म विश्लेषण सहायता प्राप्त है, और आणविक तकनीकों के सतत शोधन के लिए ंयूनतम संसाधित पूरे-माउंट नमूनों पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक वृद्धि की मांग के लिए नेतृत्व में है कुशल और न्यूनतम नमूना प्रसंस्करण तकनीक का विकास. इस प्रोटोकॉल में, हम ठीक से Arabidopsis फूल और siliques, बुनियादी समाशोधन तकनीक, और पूरे के लिए कुछ धुंधला प्रक्रियाओं प्रजनन संरचनाओं की टिप्पणियों माउंट के लिए तकनीकों का वर्णन ।
Introduction
फूल वनस्पतियों के सबसे महत्वपूर्ण परिभाषित अंगों में से हैं । फूल पौधों कुछ 90-130 मिलियन साल पहले1दिखाई दिया, और इतनी तेजी से विविध है कि उनके तेजी से उपस्थिति चार्ल्स डार्विन2द्वारा एक “घिनौना रहस्य” के रूप में वर्णित किया गया था । फूल के विकास में संयंत्र शोधकर्ताओं के हितों विविध रहे हैं । कुछ अनुसंधान एक पूरे के रूप में फूल के विकासवादी मूल समझ पर ध्यान केंद्रित किया है, या विशिष्ट संरचनात्मक, संरचनात्मक, और फूल के कार्यात्मक गुण के विकास3,4,5,6 . पुष्प रूप और संरचना में उच्च भिन्नता, साथ ही उन पर निर्भर यौन और अलैंगिक प्रजनन के तरीके, फूल एक उच्च जटिल संरचना बनाते हैं । यह विविध के लिए शरीर रचना विज्ञान और पुष्प अंगों की संरचनात्मक सुविधाओं की विशेषता प्रयासों के लिए नेतृत्व किया है, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन microscopical तकनीक है कि आनुवंशिक और आणविक जांच7के साथ जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर । इसके अलावा, फल और बीज के स्रोत के रूप में, फूल मानव और पशु पोषण के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं । इसलिए, फूल और फलों के विकास के लक्षण वर्णन अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए कई निहितार्थ है, एक बदलते परिवेश के तहत एक बढ़ती मानव आबादी और पारिस्थितिकी संरक्षण रणनीतियों के लिए खाद्य सुरक्षा सहित8 , 9 , 10.
Arabidopsis में फूल विकास फूल प्रेरण और वनस्पति meristem के परिवर्तन के साथ शुरू होता है एक फूलना (फूलों का समूह) meristem. फूल primordia फूलना meristem के पार्श्व पर बाद में शुरू कर रहे हैं11. पुष्प अंग primordia गाढ़ा whorls में बाहर से फूल के केंद्र के लिए फार्म का, और अंत में sepals में विकसित, पंखुड़ियों, पुंकेसर, और अंडप7। इन पुष्प अंगों अलग पोषक, सुरक्षात्मक, और कार्यात्मक (जैसे, परागण आकर्षण) विभिन्न प्रजातियों के पौधे, पुरुष और महिला gametophytes के विकास को बनाए रखने के साथ यौन अंगों को पूरा, क्रमशः12 , 13. gametophytes, बदले में, प्रत्येक पुरुष (शुक्राणु) और महिला gametes (अंडा और केंद्रीय सेल), जो डबल निषेचन पर एकजुट करने के लिए अगली पीढ़ी के फार्म का एक जोड़ी अंतर, युग्मनज, और प्राथमिक endosperm, एक टर्मिनल का समर्थन ऊतक भ्रूण का विकास14,15. फल और बीज विकास का समर्थन विकास, परिपक्वता, और भ्रूण के संरक्षण और, अंततः, इसके फैलाव । व्यापक अनुसंधान के लिए विभिंन प्रजातियों के पौधे में फूल और भ्रूण विकास की विशेषता प्रदर्शन किया गया है, विशेष रूप से मॉडल प्रजातियों में Arabidopsis7,16,17।
फूल विकास के प्रारंभिक सूक्ष्म विश्लेषण समय लेने वाली नमूना प्रसंस्करण और इस तरह के तेल या राल embedding और अनुभाग, प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त रूप में अवलोकन तकनीक, पर आधारित थे । इन पारंपरिक सूक्ष्म तकनीक अक्सर आणविक आनुवंशिक जांच के साथ संयोजन में उपयोग किया गया था, जैसे म्यूटेंट के microscopical विश्लेषण, सीटू संकरण में द्वारा आरएनए के स्थानीयकरण, या इंयूनो-प्रोटीन का पता लगाने. व्यापक क्षेत्र में हाल ही में प्रगति और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, के राज्य में-कला 3-डी कंप्यूटर छवि विश्लेषण सहायता प्राप्त है, और आणविक तरीकों कि ंयूनतम संसाधित पूरे पर इस्तेमाल किया जा सकता है की सतत शोधन-नमूनों माउंट, के लिए एक की जरूरत के लिए प्रेरित किया है कुशल और ंयूनतम नमूना प्रसंस्करण तकनीक है कि तरजीही मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उत्तरदाई हैं । हाल के वर्षों में, महत्वपूर्ण प्रगति पूरी-पशु नमूना माउंट पर समाशोधन तकनीक के विकास में किया गया है । वे नमूना पारदर्शी या तो जलीय यूरिया का उपयोग करके या चीनी-आधारित रिएजेंट प्रदान (उदा., स्केल, SeeDB, घन)18,19,20, या चुनिंदा द्वारा लिपिड को हटाने (डिटर्जेंट एसडीएस का उपयोग करके) के बाद स्थिर hydrogels में नमूने embedding; लिपिड को हटाने निष्क्रिय प्रसार द्वारा या तो प्राप्त किया जा सकता है (उदा, संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल21, समझौता-पार्स-22रिम्स) या सक्रिय रूप से ट्रो द्वारा (मूल स्पष्टता प्रोटोकॉल23 और अधिनियम-सफ़ाई24) । इस तेजी से प्रगति द्वारा प्रोत्साहित किया, कुछ व्युत्पंन तकनीक भी पौधों में उपयोग के लिए उभर रहे हैं ।
इस तरीके मॉडल Arabidopsisपर ध्यान केंद्रित कागज में, हम फूल कलियों, फूल, और युवा siliques के समुचित विच्छेदन के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, और पूरे के समाशोधन-विविध धुंधला और प्रेक्षण का उपयोग प्रक्रियाओं के लिए नमूने माउंट शास्त्रीय या हाल ही में एसडीएस-आधारित समाशोधन विधि । स्टार्च, callose, और क्रोमेटिन दाग के लिए उदाहरण दिए गए हैं । हालांकि इन प्रक्रियाओं और सुधार और अनुकूलन जब अंय प्रजातियों के साथ प्रयोग की जरूरत हो सकती है, हमें उंमीद है कि वे इन सरल लेकिन महत्वपूर्ण तरीकों पर है कि कई अनुसंधान परियोजनाओं के प्रारंभिक बिंदु है पर आगे अनुसंधान के लिए मंच निर्धारित करेंगे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Arabidopsisके एक एकल फूलना के भीतर कई फूल कलियों के अस्तित्व, सभी फूल विकास के चरणों में फैले, एक उपचार या विकासात्मक सुविधा का एक प्रभाव निस्र्पक के उद्देश्य से अध्ययन के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है एक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के ज्यूरिख विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, एक आईईएफ मैरी क्यूरी अनुदान (अनुदान no. TransEpigen-२५४७९७ करने के लिए A.H.), यूरोपीय अनुसंधान परिषद के एक उंनत अनुदान (अनुदान सं । MEDEA-२५०३५८ करने के लिए U.G.), और एक अनुसंधान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना (अनुदान MecanX करने के लिए U.G.) से SystemsX.ch, सिस्टम जीवविज्ञान में स्विस पहल.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
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