Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Summary

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Abstract

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Introduction

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões¹e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um “abominável mistério” por Charles Darwin². Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores^3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares⁷. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente^{8 , 9 , 10}.

Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência¹¹. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos⁷. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,^{12 , 13}. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião^14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis^7,16,17.

Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)^18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo²¹, pacto-PARS-aros²²) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo²³ e PRESTO ACT²⁴). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.

Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.

Protocol

1. a flor e a fixação de síliqua Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores.Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrient…

Representative Results

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos25,<sup class="x…

Discussion

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a fl…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.