Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Summary

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Abstract

A causa di suoi strumenti formidabili per studi di genetica molecolare, Arabidopsis thaliana è una delle più importanti specie modello in biologia vegetale e, soprattutto, in biologia riproduttiva delle piante. Tuttavia, pianta morfologica, anatomica e le analisi ultrastrutturali tradizionalmente coinvolgono l’incorporamento richiede tempo e sezionamento procedure per campo chiaro, scansione e microscopia elettronica. Recenti progressi nella microscopia a fluorescenza confocale, state-of-the-art 3D computerizzata analisi al microscopio e il continuo affinamento delle tecniche molecolari per essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un aumento della domanda di lo sviluppo di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale. In questo protocollo, descriviamo le tecniche per la dissezione correttamente Arabidopsis fiori e silique, compensazione, tecniche di base e alcune procedure di macchiatura per intero-monta le osservazioni di strutture riproduttive.

Introduction

I fiori sono tra i più importanti definizione organi delle angiosperme. Piante da fiore è comparso circa 90 milioni anni fa¹e così in fretta che loro aspetto rapido è stato descritto come un “abominevole mistero” di Charles Darwin²diversificato. Gli interessi dei ricercatori di pianta in sviluppo fiorale sono diversi. Alcune ricerche si sono concentrate sulla comprensione l’origine evolutiva del fiore nel suo insieme, o l’evoluzione delle specifiche proprietà anatomiche, strutturali e funzionali di fiori^3,4,5,6 . La variazione alta in floral forma e struttura, nonché le modalità di riproduzione sessuale e asessuale affidamento su di loro, fare il fiore una struttura altamente complessa. Ciò ha portato a diversi sforzi per caratterizzare le caratteristiche strutturali e di anatomia degli organi floreali, utilizzando tecniche di microscopico dell’elettrone e della luce che potrebbero combinarsi con le indagini genetiche e molecolari⁷. Inoltre, come la fonte di frutti e semi, i fiori sono di fondamentale importanza per l’alimentazione umana e animale. Di conseguenza, la caratterizzazione dello sviluppo del fiore e frutta ha molte implicazioni per la ricerca applicata, compresa la sicurezza di cibo per una popolazione umana sempre maggiore e strategie di conservazione ecologica sotto un cambiamento di ambiente^{8 , 9 , 10}.

Lo sviluppo del fiore in Arabidopsis inizia con induzione a fiore e la trasformazione del meristema vegetativo di un meristema infiorescenza (gruppo di fiori). Primordia fiore vengono avviate lateralmente sul fianco del meristema infiorescenza¹¹. I primordi dell’organo floreale formano progressivamente in verticilli concentrici dall’esterno al centro del fiore e alla fine trasformarsi in sepali, petali, stami e carpelli⁷. Questi organi floreali soddisfano distinta nutritiva, protettiva e funzionale (ad es., attrazione impollinatore) ruoli in diverse specie vegetali, con gli organi sessuali, sostenere lo sviluppo dei gametofiti maschili e femminili, rispettivamente^{12 , 13}. i gametofiti, a sua volta, ciascuna differenziano un paio di uomo (sperma) e gameti femminili (uovo e centrale delle cellule), che uniscono al momento doppia fertilizzazione per formare la prossima generazione, lo zigote e l’endosperma primario, un terminale del tessuto di sostegno del sviluppo dell’embrione^14,15. Frutta e semi di sviluppo supportano la crescita, maturazione e conservazione dell’embrione e, alla fine, la sua dispersione. Un’ampia ricerca è stata eseguita per caratterizzare lo sviluppo dell’embrione e del fiore in diverse specie di piante, soprattutto nelle specie modello Arabidopsis^7,16,17.

Analisi al microscopio precoce dello sviluppo del fiore erano basati su elaborazione del campione richiede tempo e osservazione tecniche, come la paraffina o l’incorporamento di resina e di sezionamento, combinato con la luce o la microscopia elettronica. Queste tecniche microscopiche tradizionale sono stati spesso utilizzate in combinazione con le indagini genetiche molecolari, quali analisi microscopiche di mutanti, la localizzazione di RNA tramite l’ibridazione in situ o immuno-rivelazione di proteine. Recenti progressi nella microscopia di fluorescenza grandangolari e confocale, nelle analisi di immagine computerizzata 3D in state-of-the-art e il continuo perfezionamento dei metodi molecolari che può essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un’esigenza di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale che sono preferenzialmente favorevoli ad analisi quantitative. Negli ultimi anni, significativi progressi compiuti nello sviluppo di tecniche di compensazione sull’esemplare animale intero-monta. Che rendono il campione trasparente utilizzando i reagenti di zucchero-base acquosa o di urea (ad es., scala, SeeDB, CUBIC)^18,19,20, o rimuovendo selettivamente i lipidi (usando il detersivo SDS) dopo incorporamento di campioni in idrogel stabili; la rimozione dei lipidi può essere raggiunto mediante diffusione passiva (ad esempio, modifica chiarezza protocollo²¹, patto-PARS-cerchi²²) o attivamente mediante elettroforesi (originale chiarezza protocollo²³ e ACT-PRESTO²⁴). Incoraggiato da questo progresso veloce, alcune tecniche derivate stanno emergendo anche per utilizzo in impianti.

In questo articolo di metodi focalizzato sul modello Arabidopsis, descriviamo la procedura per la corretta dissezione di boccioli di fiori, fiori e giovani silique e lo schiarimento dei campioni del intero-monta per la diversa colorazione e utilizzando le procedure di osservazione classica o un recente metodo di compensazione basati su SDS. Vengono forniti esempi per amido, callosio e macchiatura della cromatina. Anche se queste procedure potrebbero essere necessario ulteriori miglioramenti e adeguamenti quando utilizzato con altre specie, ci auguriamo di che essi porranno le basi per ulteriori ricerche su questi metodi semplici ma fondamentali che sono il punto di partenza di molti progetti di ricerca.

Protocol

1. fiore e anemofila fissazione Silique da piante e fiori raccolto sincronizzate all’apertura del primo fiore.Nota: Nelle circostanze sperimentali utilizzati qui, piante iniziano la fioritura circa 21 giorni dopo il trapianto da piastre di Murashige e Skoog (MS) al suolo. Semi sono stratificate per 3 – 4 giorni a 4 ° C e germinato/coltivate su piastre di MS a 22 ° C/16 h luce e 18 ° C/8 h scura per 8 a 10 giorni, prima del trapianto le piantine sul suolo ricco di sostanze nutritive in vasi tenuti sotto…

Representative Results

Arabidopsis appartiene alla famiglia Brassicacea, cuscinetto infiorescenze con fiori bisessuali disposti in un corimbo (Figura 1). Ogni fiore ha quattro sepali, petali di quattro, sei stami (quattro lunghi e due brevi) e un sincarpio gineceo costituito da due carpelli congenitamente fuse (Figura 1F-H) disposti in verticilli concentrici quattro25,26</su…

Discussion

L’esistenza di molti boccioli di fiori all’interno di una singola infiorescenza di Arabidopsis, che coprono tutte le fasi di sviluppo del fiore, offre un’opportunità unica per studi mirati alla caratterizzazione di un effetto di un trattamento o una caratteristica inerente allo sviluppo contemporaneamente attraverso le diverse fasi dello sviluppo del fiore. Un buon punto di riferimento tra le diverse singole piante è l’apertura del primo fiore dell’infiorescenza principale. Piante sono trattate in modo tale ch…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.