إنشاء نماذج الماوس للاضطرابات العصبية التي يسببها فيروس Zika استخدام استراتيجيات حقن Intracerebral: الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار
Summary
هنا يصف لنا طريقة لوضع نموذج لصغر الرأس التي يسببها فيروس زيكا في الماوس. ويشمل هذا البروتوكول أساليب التطعيم intracerebral الجنينية والأطفال حديثي الولادة، ومرحلة الكبار فيروس زيكا.
Abstract
فيروس زيكا (زيكف) مصفر مستوطنة حاليا في شمال ووسط وجنوب أمريكا. من الثابت الآن أن زيكف يمكن أن يسبب صغر الرأس وتشوهات الدماغ إضافية. ومع ذلك، الآلية الأساسية لأمراض ال زيكف في المخ النامي لا يزال غير واضح. كثيرا ما تستخدم الطرق الجراحية intracerebral في أبحاث علم الأعصاب لمعالجة مسائل حول تطور الدماغ العادية وغير العادية ووظيفة المخ. هذا البروتوكول يستخدم التقنيات الجراحية الكلاسيكية، ووصف الطرق التي تسمح بالمرتبطة زيكف نموذج البشرية الأمراض العصبية في الجهاز العصبي الماوس. بينما نموذج التطعيم الدماغ مباشرة لا الوضع العادي من انتقال الفيروس، يسمح الأسلوب المحققين طرح أسئلة هادفة بشأن النتيجة بعد الإصابة زيكف في المخ النامي. ويصف هذا البروتوكول المراحل الجنينية والمواليد الجدد، والكبار من التطعيم داخل البطيني من زيكف. حالما يتقن، يمكن أن يصبح هذا الأسلوب أسلوب مباشر واستنساخه يستغرق سوى ساعات قليلة لأداء.
Introduction
صغر الرأس شرط الناجمة عن نمو الدماغ المعيبة تتميز بأقل من متوسط حجم الرأس في الأطفال حديثي الولادة. الأطفال مع صغر الرأس يحمل مجموعة من الأعراض التي يمكن أن تشمل تأخر في النمو والاستيلاء والإعاقة الذهنية، وفقدان السمع، ومشاكل في الرؤية ومشاكل في الحركة والتوازن، بين أمور أخرى، اعتماداً على شدة المرض و تسبب2،،من13. هذا الشرط المتعددة العوامل في طبيعتها، مع عامل الوراثي، والمعدية، والعوامل البيئية المرتبطة بالتسبب في صغر الرأس4،،من56،،من78، 9. وقبل اندلاع زيكف عام 2015-2016، تم تشخيص 8 أطفال من أصل عشرة آلاف ولادة مع صغر الرأس في الولايات المتحدة وفقا لمركز السيطرة على الأمراض10. ش يوم 1 شباط/فبراير من عام 2016 أعلنت “منظمة الصحة العالمية” أن الفيروس Zika “الطوارئ الصحة العامة من القلق الدولي” سبب الزيادة المزعجة في التشخيص صعل المرتبطة بالعدوى زيكف في الأمهات11، 12. وتقترح دراسة حديثة من مركز السيطرة على الأمراض في حالات زيكف في الولايات المتحدة قد أسفرت نتائج الإصابة زيكف الأم إلى خطر زيادة برنامج لطفل لتطوير صعل مقارنة بالأفراد غير مصاب، و 4 في المائة من الأمهات المصابة زيكف من الولايات المتحدة الأمريكية الأطفال مع صغر الرأس11. أبلغ عن معدل العيوب الخلقية المرتبطة بصغر الرأس أثناء الحمل من الإصابة زيكف في البرازيل قد أثرت تصل إلى 17 في المائة من الأطفال الرضع في الأمهات المصابات بالفيروس، مما يشير إلى أن عوامل أخرى في أمريكا اللاتينية قد يسهم في زيادة مخاطر 13-وفي حين أننا نعرف أن زيكف يمكن أن يسبب صغر الرأس والمرضية في السلف العصبية خلية (مجلس الشعب) السكان7،،من814، الدماغ المرضية كاملة من زيكف في البلدان النامية لا يزال بعيد المنال. من المهم تطوير نماذج حيوانية لمواصلة التحقيق آليات المرض الكامنة وراء شذوذ الدماغ المرتبطة بالإصابة زيكف.
لمباشرة دراسة تفيد بأن زيكف على نمو الدماغ، وضعنا أول طراز ماوس باستخدام تطعيم اليوم الجنينية 14.5 (E14.5) المخ intracerebral مع زيكف7. تم اختيار هذه المرحلة كما أنه يعتبر الممثل لنهاية الاثلوث الأول في الحمل البشرية14. الجراء يمكن البقاء على قيد الحياة حتى اليوم بعد الولادة 5 (P5) مع هذا الأسلوب حقن intracerebral الجنينية (~ 1 ميليلتر من 1.7 × زراعة الأنسجة6 10 الجرعة المعدية (TCID50/mL)). هذه الجراء بعد الولادة يحمل مجموعة من تعمل وبالمثل لوحظ في الرضع البشرية المصابة بما في ذلك البطينين الموسع وفقدان الخلايا العصبية والاستنفاد محواري، أستروجليوسيس، و microglial التنشيط12،15. دماغ الفأر حديثي الولادة غير ناضجة نسبيا، أقرب إلى مرحلة النمو في الدماغ البشري في منتصف الأسبوع الحملي16، ونمو الدماغ الماوس يتضمن عنصرا رئيسيا بعد الولادة. دراسة الحمل فيما بعد مرحلة العدوى، كما يتم وصف طريقة للعدوى بعد الولادة. حديثي الولادة المصابين زيكف في P1 قادرة على البقاء على قيد الحياة حتى لحقن بعد 13 يوما. مرحلة الكبار ولد الدم العدوى قد وصفت في الماوس سابقا17 لكنها تتطلب الاستخدام عوامل النسخ العوامل التنظيمية (المتكامل) انترفيرون (IFN) المتكامل-3،-5، سلالة-7 ثلاثية خروج المغلوب. ويصف هذا البروتوكول طريقة لتطعيم زيكف إينترافينتريكولارلي للتحايل على تعطيل الاستجابة المضادة للفيروسات لنموذج مورين في الكبار. بينما هذا تلتف المناعي مورين، هذا الطريق من الحقن لا تقليد مباشرة مسار نموذجي للعدوى. لمعالجة هذا التناقض مباشرة، يمكن أداء المجرب عدوى داخل الرحم من زيكف بدلاً من الطريق داخل الجمجمة. اتخذ من العمل السابق18، التي وصفناها بإيجاز هذا الأسلوب في هذا البروتوكول العدوى الجنينية.
سلالات الفيروس Zika تنفيذها مع هذه التقنية تشمل عزل المكسيكية7،MEX1-4419 والأفريقية عزل السيد-766 معزولة في عام 194720. MEX1 زكى-44 كانت معزولة في ولاية شياباس بالمكسيك في كانون الثاني/يناير 2016 من المصابين بعوض الزاعجة المصرية البعوض. حصلنا على هذا الفيروس بإذن من خلال الفرع الطبي بجامعة تكساس في غالفستون (يزيد). وبالإضافة إلى ذلك، تم تلقيح حمى الضنك فيروس النمط المصلي المسيطر 2 (DENV2) استخدام هذا الأسلوب في دراسة مقارنة. DENV2، سلالة S16803 (تسلسل GU289914 بنك الجينات)، كانت معزولة من عينة مريض من تايلاند في عام 1974، وباساجيد في الخلايا C6/36. الفيروس باساجيد مرتين في الخلايا فيرو بمركز المرجع العالمي “الفيروسات الناشئة” وسيتناقش (ورسيفا) قبل الحقن الماوس. وهذا يدل على أن هذا الأسلوب يعمل بنفس القدر أيضا لسلالات متنوعة من زيكف وفلافيفيروسيس الأخرى التي قد يكون لها تأثير على نمو الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
الموصوفة هنا أسلوب التطعيم إينتراسيريبرال زيكف في مراحل الأجنة والأطفال حديثي الولادة والكبار لتحقيق الأضرار التي يسببها زيكف في نمو الدماغ. بينما مباشرة، وهناك بعض الاعتبارات التي ينبغي أن المحققين لضمان نوعية الدراسة وسلامة الأشخاص المعنيين.
DENV ارتباطاً وثيقا زيكف في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن ينوه الدكتور عبد اللطيف بينريس في جامعة روتشستر للإرشاد والمناقشات ذات الصلة بتعلم الكبار الجراحية وتقنيات الوليد. الكتاب تود أيضا أن نعترف بالدكتور جيمس لودرديل في UGA لاستخدام معدات ستيريوتاكسيك والمناقشات المتعلقة بإعداد المنهجية لهذا الأسلوب، والنهوض بمؤسسة بحوث كلية العلماء (الأقواس) لما الدعم ودعمنا المعاهد الوطنية للصحة (NINDS المنح R01NS096176-02، R01NS097231-01 و F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
