İntraserebral enjeksiyon stratejileri kullanarak Zika virüs kaynaklı nörolojik bozukluklar için fare modelleri oluşturma: embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin
Summary
Burada fare Zika virüs kaynaklı microcephaly bir model oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin-sahne intraserebral aşılama Zika şunun için yöntemler içerir.
Abstract
Zika (ZIKV) bir flavivirus Kuzey, orta ve Güney Amerika’da şu anda endemik virüstür. Şimdi ZIKV microcephaly ve ek beyin anormallikler neden olabilir kuruldu. Ancak, gelişmekte olan beyin ZIKV patogenezinde temel mekanizması belirsizdir. İntraserebral cerrahi yöntemler sık nörolojik araştırma soruları normal ve anormal beyin gelişimi ve beyin fonksiyonu hakkında için kullanılır. Bu iletişim kuralı klasik cerrahi teknikler kullanır ve modeli ZIKV ilişkili insan nörolojik hastalık için fare sinir sisteminde izin yöntemleri açıklar. Doğrudan beyin aşı virüs iletim normal moda model değil iken, yöntemi müfettişler sonucu gelişen beyin ZIKV enfeksiyon sonra ilgili hedeflenen sorular sormak sağlar. Bu iletişim kuralı ZIKV, İntraventriküler aşılama embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin aşamaları açıklar. Hakim sonra bu yöntem sadece gerçekleştirmek için birkaç saat sürer bir basit ve tekrarlanabilir teknik haline gelebilir.
Introduction
Microcephaly hastalarda ortalama baş boyutundan küçük ile karakterize arızalı beyin gelişimi kaynaklanan bir durumdur. Microcephaly çocuklarla gelişimsel gecikme, nöbet, Fikri Engellilik, işitme kaybı, görme sorunları ve hareket ve denge, diğerlerinin yanı sıra, hastalığın şiddetine bağlı olarak sorunları kapsayan belirtiler bir dizi Sergi ve 1,2,3neden. Doğada, genetik, bulaşıcı Ajan ve microcephaly4,5,6,7,8neden için bağlantılı çevresel faktörler ile multifaktöriyel bir durumdur, 9. 2015-2016 ZIKV patlak önce10CDC göre Amerika Birleşik Devletleri’nde microcephaly ile 10.000 doğumlular 8 çocuktan tanısı konuldu. Üzerinde Şubat 1st 2016 Dünya Sağlık Örgütü Zika virüs bir halk sağlığı acil durum uluslararası endişe microcephaly tanı anneler11, ZIKV enfeksiyonu ile ilişkili endişe verici artış nedeniyle ilan 12. CDC ZIKV olgu Amerika Birleşik Devletleri’nde son çalışmada anne ZIKV enfeksiyon sonuçlarında bir 20-fold etkilenmemiş bireyler ve enfekte ZIKV annelerin % 4’ü ABD karşılaştırıldığında microcephaly geliştirmek bir çocuk riski içinde sonuçlandı öneriyor microcephaly11çocuklu. Microcephaly ilişkili doğum kusurları ZIKV enfeksiyon Brezilya gebelikte oranı virüslü anneler, Latin Amerika’da diğer faktörler riski için katkı olabilir gösteren bebeklerde % 17’e kadar etkilediğini bildirilmiştir 13. biliyoruz ZIKV microcephaly ve Escherichia türleri içinde nöral progenitör hücre (NPC) nüfus7,8,14neden olabilir iken, gelişmekte olan ZIKV tam patogenezinde beyin zor kalır. ZIKV enfeksiyonu ile ilişkili beyin anormallikler altta yatan hastalık mekanizmaları daha ayrıntılı araştırmaya hayvan modelleri geliştirmek önemlidir.
Doğrudan ZIKV beyin gelişimi etkisini incelemek için ilk embriyonik gün 14,5 (E14.5) beyin intraserebral aşı ile ZIKV7kullanarak fare modeli geliştirdi. İlk üç aylık dönemde insan gebelik14sonu temsilcisi olarak kabul edilir gibi bu aşamada seçildi. Yavrular bu embriyonik intraserebral enjeksiyon yöntemi ile doğum sonrası gün 5 (P5) kadar yaşayabilir (~ 1.7 x 106 doku kültürü infektif doz (TCID50/mL) 1 µL). Bu doğum sonrası pups fenotipleri benzer şekilde genişlemiş ventriküller, nöronal kayıp, aksonlar rarefaction, astrogliosis ve mikroglial harekete geçirmek12,15gibi enfekte insan bebeklerde gözlenen bir dizi Sergi. Yeni doğmuş fare beyin nispeten olgunlaşmamış, benzer-e doğru orta gebelik16insan beyni gelişim aşaması ve fare beyin gelişimi ana postnatal bileşeni içerir. Daha sonra gebelik sahne enfeksiyonlar çalışmaya, postnatal enfeksiyon için bir yöntem de tanımlanır. Yenidoğan Bebeklerin ZIKV, P1 ile enfekte kadar 13 gün sonrası enjeksiyon için hayatta kalmak edebiliyoruz. Yetişkin sahne kan tarihi enfeksiyon fare içinde17 gerektiriyor ama daha önce açıklanan IRF-3, -5,-7 Çift Kişilik nakavt zorlanma interferon (IFN) düzenleyici faktörü (IRF) transkripsiyon faktörleri. Bu iletişim kuralı ZIKV intraventricularly yetişkin fare modelinde antiviral yanıt devre dışı bırakma aşmak için aşı yöntemi açıklar. Bu fare bağışıklık sistemi kaçınmanızı sağlar iken, bu rota enjeksiyon doğrudan tipik yolu enfeksiyonu taklit değil. Bu tutarsızlık adrese doğrudan, deneyci intrauterin enfeksiyon ZIKV kafa içi yol yerine gerçekleştirebilirsiniz. Önceki iş18kabul, kısaca bu embriyonik enfeksiyon Protokolü Bu teknikte anlatmıştık.
Bu teknik ile uygulanan Zika virüs suşları Meksika izole MEX1-447,19 içerir ve Afrikalı Bay-766 194720dakika içinde izole yalıtır. Zika MEX1-44 Ocak 2016 gelen virüslü bir Aedes aegypti içinde Chiapas, Meksika içinde izole sivrisinek. Biz Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi, Galveston (UTMB) aracılığıyla izni ile bu virüs elde. Buna ek olarak, dang virüs serotip 2 (DENV2) bu tekniği kullanarak bir karşılaştırma çalışmada aşı. DENV2, zorlanma S16803 (sırası GenBank GU289914), 1974 yılında Tayland hasta bir örnekten izole edildi ve C6/36 hücrelerde pasajlı. Virüs Vero hücreleri iki kez dünya referans Merkezi tarafından ortaya çıkan virüs ve Arboviruses (WRCEVA) için fare enjeksiyonları önce pasajlı. Bu bu teknik aynı şekilde çalıştığını gösterir ZIKV ve beyin gelişimi üzerinde etkisi diğer flaviviruses farklı suşları için iyi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan ZIKV intraserebral aşı beyin gelişiminde ZIKV kaynaklı zararların soruşturma için embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin aşamalarında için bir yöntemdir. Basit olsa da, müfettişlerin çalışma kalitesi ve güvenliği ile ilgili bu emin olmak için gerçekleştirmeniz gereken bazı hususlar vardır.
DENV ZIKV için flavivirus cins yakından ilgilidir. DENV Pediatrik beyin bozukluğu insanlarda nedensel bağlanmamış. DENV2 başarılı bir şekilde bulaştırmak ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Abdellatif Benraiss Rochester Üniversitesi rehberlik ve tartışmalar için yetişkin cerrahi ve kardiyolojik teknikleri öğrenme ile ilgili kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Dr. James Lauderdale adlı UGA onun stereotaksik ekipman ve tartışmalar kullanımı için ilgili bu tekniği için metodoloji ve ilerlemesi için araştırma üniversite bilim adamları (yay) temel için ayarlamak kabul etmek istiyorum onların ve bizim NIH desteği (R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01 NINDS verir).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
