Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto
Summary
Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.
Abstract
O vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus atualmente endêmica na América do Sul, Central e do Norte. Agora está estabelecido que o ZIKV pode causar microcefalia e anormalidades cerebrais adicionais. No entanto, o mecanismo subjacente a patogênese da ZIKV no cérebro em desenvolvimento permanece obscuro. Intracerebrais métodos cirúrgicos são frequentemente usados em pesquisas de neurociência para responder a perguntas sobre o desenvolvimento normal e anormal do cérebro e a função cerebral. Este protocolo utiliza técnicas cirúrgicas clássicas e descreve os métodos que permitem que um modelo associado a ZIKV humana doença neurológica no sistema nervoso do rato. Enquanto inoculação direta do cérebro não modelar o modo normal de transmissão do vírus, o método permite que os investigadores perguntas específicas relativas a consequência após infecção ZIKV do cérebro em desenvolvimento. Este protocolo descreve estágios embrionários, Neonatais e adultos de inoculação intraventricular de ZIKV. Uma vez dominado, este método pode tornar-se uma técnica simples e reprodutível que leva apenas algumas horas para executar.
Introduction
Microcefalia é uma condição resultante do desenvolvimento do cérebro defeituoso caracterizado por menor do que o tamanho médio da cabeça em recém-nascidos. Crianças com microcefalia apresentam uma gama de sintomas que podem incluir atraso de desenvolvimento, convulsões, deficiência intelectual, perda de audição, problemas de visão e problemas com movimento e equilíbrio, entre outros, dependendo da gravidade da doença e causa a1,2,3. Esta condição é multifatorial na natureza, com o agente infeccioso, genética e fatores ambientais relacionados ao causar microcefalia4,5,6,7,8, 9. Antes da eclosão de 2015-2016 ZIKV, 8 crianças fora do 10.000 nascimentos foram diagnosticadas com microcefalia nos Estados Unidos de acordo com o CDC10. 1 de fevereiro nost de 2016, a Organização Mundial de saúde declarou o vírus Zika uma emergência de saúde pública internacional preocupação devido ao aumento alarmante no diagnóstico de microcefalia associada com infecção ZIKV em mães11, 12. Um estudo recente do CDC em casos ZIKV nos Estados Unidos sugere que resultados de infecção maternos ZIKV em um 20-fold aumento do risco de uma criança desenvolver microcefalia em comparação com indivíduos não infectados e 4% das mães infectada de ZIKV dos EUA resultaram em crianças com microcefalia11. A taxa de defeitos de nascimento associada a microcefalia durante a gravidez de infecção de ZIKV no Brasil foram relatados para ter afetado até 17% dos bebês de mães infectadas, indicando que outros fatores na América Latina podem estar contribuindo para o aumento do risco 13. enquanto nós sabemos que o ZIKV pode causar microcefalia e patogênese em progenitoras neurais celular (NPC) população7,8,14, completa patogênese da ZIKV no desenvolvimento do cérebro Ainda não se alcançou. É importante desenvolver modelos animais para investigar os mecanismos de doença subjacente as anormalidades do cérebro associadas com infecção ZIKV.
Para estudar diretamente o efeito que o ZIKV tem no desenvolvimento do cérebro, nós primeiro desenvolveu um modelo de rato usando inoculação intracerebral do cérebro de (E14.5) 14,5 dia embrionário com ZIKV7. Nesta fase foi escolhida como considera-se representante do fim do primeiro trimestre de gestação humana14. Filhotes podem sobreviver até dia pós-natal 5 (P5) com este método de injeção intracerebral embrionário (~ 1 µ l de 1.7 x 106 cultura do tecido dose infecciosa (TCID50/mL)). Esses filhotes pós-natal exibem uma variedade de fenótipos da mesma forma observada em lactentes humanos infectados, incluindo ventrículos alargados, perda neuronal, rarefação axonal, astrogliosis e microglial ativação12,15. Um cérebro de rato recém-nascido é relativamente imaturo, semelhante à fase de desenvolvimento do cérebro humano no meio da gestação16, e desenvolvimento do cérebro do rato inclui um componente importante de pós-natal. Para estudar mais tarde infecções de fase de gestação, um método para infecção pós-Natal também é descrito. Neonatos infectados com ZIKV no P1 são capazes de sobreviver à pós-injeção de 13 dias. Infecção do sangue-nascido em fase adulta tem sido descrita no mouse anteriormente17 mas exige o uso de fatores de transcrição de fator regulador (IRF) o interferon (IFN) IRF-3, -5, estirpe de nocaute triplo-7. Este protocolo descreve um método de inoculação de ZIKV intraventricularly para contornar desativando a resposta antiviral do modelo murino no adulto. Enquanto isto contorna o sistema imunológico murino, esta via de injeção não imitar diretamente a rota típica de infecção. Para resolver esta discrepância, diretamente, o experimentador pode executar uma infecção intra-uterina de ZIKV em vez da rota intracraniana. Adotado a partir de trabalho anterior18, brevemente descrevemos esta técnica neste protocolo infecção embrionária.
As estirpes de vírus Zika implementadas com esta técnica incluem o mexicano isolado de7,MEX1-4419 e o africano isolar senhor-766 isolado em 194720. Zika MEX1-44 foi isolado em Chiapas, no México, em janeiro de 2016 de um infectado Aedes aegypti mosquito. Obtivemos deste vírus com permissão através da University of Texas Medical Branch em Galveston (UTMB). Além disso, o sorotipo do vírus Dengue (DENV2) de 2 foi inoculado usando esta técnica em um estudo de comparação. DENV2, estirpe S16803 (sequência GenBank GU289914), foi isolada a partir de uma amostra do paciente da Tailândia em 1974 e passadas em células C6/36. O vírus foi passado duas vezes em células Vero, pelo centro de referência mundial de vírus emergentes e arbovírus (WRCEVA) antes de injeções de rato. Isto demonstra que esta técnica funciona igualmente bem para diversas cepas de ZIKV e outros flavivírus que podem ter um impacto no desenvolvimento do cérebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito aqui é um método de inoculação intracerebral do ZIKV em fases embrionárias, Neonatais e adultos para a investigação de danos ZIKV-induzida no desenvolvimento do cérebro. Embora simples, há algumas considerações que os investigadores devem tomar para garantir a qualidade do estudo e a segurança dos envolvidos.
DENV está intimamente relacionado com a ZIKV do gênero flavivirus. DENV não tem sido associada causalmente com desordens cerebrais pediátricos nos seres humanos. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Abdellatif Benraiss na Universidade de Rochester para sua orientação e discussões relevantes para a aprendizagem do adulto cirúrgico e técnicas em recém-nascidos. Os autores também gostaria de reconhecer o Dr. James Lauderdale na UGA para o uso de seus equipamentos estereotáxicos e discussões relacionadas a criação de metodologia para esta técnica e o avanço para a Fundação de pesquisa faculdade cientistas (arcos) para sua suporte e apoio ao NIH (NINDS concede R01NS096176-02, 01-R01NS097231, & F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
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