Etablere musen modeller for Zika Virus-indusert nevrologiske lidelser Intracerebral injeksjon strategier: embryonale neonatale og voksne
Summary
Her beskriver vi en metode for å opprette en modell av Zika forårsaket av virus microcephaly i mus. Denne protokollen inneholder metoder for embryonale neonatale og voksne-trinns intracerebral vaksinasjon av Zika viruset.
Abstract
Zika viruset (ZIKV) er en flavivirus er endemisk i Nord-, sentral- og Sør-Amerika. Det er nå etablert at ZIKV kan forårsake microcephaly og flere hjernen unormalt. Mekanismen bak patogenesen av ZIKV i utvikle hjernen er imidlertid uklart. Intracerebral kirurgiske metoder brukes ofte i nevrovitenskap forskning å svare på spørsmål om både normale og unormale hjernens utvikling og hjernefunksjon. Denne protokollen bruker klassiske kirurgiske teknikker og beskriver metoder som tillater en å modell ZIKV-assosiert menneskelige nevrologisk sykdom i nervesystemet musen. Mens direkte hjernen inoculation ikke modell normalmodus for virus smitte, tillater den etterforskerne å stille målrettet spørsmål om konsekvensen etter ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Denne protokollen beskriver embryonale neonatale og voksne stadier av intraventricular vaksinasjon av ZIKV. Når mestret, kan denne metoden blitt en enkel og reproduserbar metode som tar bare et par timer utføre.
Introduction
Microcephaly er en tilstand som følge av defekte hjernens utvikling preget av mindre enn gjennomsnittlig hode størrelse i nyfødte. Barn med microcephaly forevise en omfang av symptomer som kan inkludere utviklingsmessige forsinkelser, beslag, intellektuelle handikap, hørselstap, synsproblemer og problemer med bevegelse og saldo, blant annet avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen og forårsake1,2,3. Denne tilstanden er multifaktoriell i naturen, med genetisk, smittsomme agent, og miljømessige faktorer knyttet til forårsaker microcephaly4,5,6,7,8, 9. Før 2015-2016 ZIKV utbruddet, ble 8 barn ut av 10 000 fødsler diagnostisert med microcephaly i USA Ifølge CDC10. På februar 1st i 2016 Verdens helseorganisasjon erklært Zika viruset en Public Health Emergency av International bekymring på grunn av alarmerende økningen i microcephaly diagnoser knyttet ZIKV infeksjon i mødre11, 12. En fersk undersøkelse fra CDC på ZIKV tilfeller i USA viser at mødre ZIKV infeksjon resultater 20-fold økt fare for et barn å utvikle microcephaly forhold til uninfected enkeltpersoner og 4% av ZIKV infisert mødre fra USA har resultert i barn med microcephaly11. Frekvensen av microcephaly-assosiert fødselsskader i svangerskapet fra ZIKV infeksjon i Brasil har blitt rapportert å ha påvirket opptil 17% av babyer i infiserte mødre, som angir at andre faktorer i Latin-Amerika kan bidra til økt risiko 13. selv om vi vet at ZIKV kan forårsake microcephaly og patogenesen i nevrale celle (NPC) befolkningen7,8,14, komplett patogenesen av ZIKV i utviklingsland hjernen er fortsatt flyktig. Det er viktig å utvikle dyremodeller for ytterligere å undersøke sykdom mekanismene bak hjernen forandringene knyttet ZIKV infeksjon.
Å direkte studere effekten at ZIKV har på hjernens utvikling, utviklet vi en musemodell med intracerebral vaksinasjon av embryonale dag 14,5 (E14.5) brain med ZIKV7. Denne scenen ble valgt som regnes som representant for slutten av første trimester i menneskelig svangerskapet14. Pups kan overleve til postnatal dag 5 (P5) med denne embryonale intracerebral injeksjon metoden (~ 1 µL av 1,7 x 106 vev kultur infeksiøs dose (TCID50/mL)). Disse postnatal pups forevise en omfang av fenotyper tilsvarende observert i infiserte menneskelige spedbarn inkludert utvidet ventriklene, neuronal tap, axonal rarefaction, astrogliosis og microglial aktivisering12,15. Nyfødte musen hjernen er relativt umodne, beslektet med det utviklingen scenen av den menneskelige hjernen på midten av svangerskapet16musen hjernens utvikling omfatter et postnatal hovedkomponenten. For å studere senere svangerskapet scenen infeksjoner, er en metode for postnatal infeksjon også beskrevet. Nyfødte infisert med ZIKV på P1 er kjøpedyktig overleve opp til 13 dager etter injeksjon. Blod-født voksen stadium infeksjon har blitt beskrevet i musen tidligere17 men krever bruk av interferon (IFN) regulatoriske faktor (IRF) transkripsjon faktorer IRF-3,-5,-7 trippel knockout belastning. Denne protokollen beskriver en metode for å vaksinere ZIKV intraventricularly for å omgå deaktivering antiviral svaret av murine modellen i voksen. Mens dette omgår murine immunforsvaret, ikke denne ruten av injeksjon, direkte etterligne typisk ruten av infeksjon. For å løse dette avviket direkte, kan eksperimentator utføre en intrauterine infeksjon i ZIKV i stedet for intrakranielt ruten. Vedtatt tidligere arbeid18, har vi kort beskrevet denne teknikken i denne embryonale infeksjon protokollen.
Zika viruset stammer implementert med denne teknikken inkluderer den meksikanske isolere MEX1-447,19 og afrikanske isolere MR-766 isolert i 194720. Zika MEX1-44 ble isolert i Chiapas, Mexico i januar i 2016 fra en infisert Aedes aegypti mygg. Vi fikk dette viruset med tillatelsen gjennom University of Texas Medical Branch i Galveston (UTMB). I tillegg ble Dengue virus serotype 2 (DENV2) inokulert bruker denne teknikken i en studie. DENV2, stamme S16803 (sekvens GenBank GU289914), ble isolert fra en pasient utvalg fra Thailand i 1974 og passaged i C6/36 celler. Viruset ble passaged to ganger i Vero celler av verden referanse Center for Emerging virus og Arboviruses (WRCEVA) før musen injeksjoner. Dette viser at denne teknikken fungerer like godt for ulike stammer av ZIKV og andre flaviviruses kan ha en innvirkning på hjernens utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er en metode for intracerebral vaksinasjon av ZIKV på embryonale neonatale og voksne stadier for etterforskningen av ZIKV-indusert skader i hjernens utvikling. Mens enkelt, er det noen hensyn som etterforskerne tar for å sikre kvaliteten på studien og sikkerheten til de involverte.
DENV er nært knyttet til ZIKV i flavivirus slekten. DENV er ikke causally koblet med pediatric hjernen lidelser hos mennesker. DENV2 kan infisere og gjenskape i utvikle hjernen med metoden embryona…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Abdellatif Benraiss ved University of Rochester for hans mentor og diskusjoner relevant for lære voksen kirurgiske og neonate teknikker. Forfatterne vil også erkjenner Dr. James Lauderdale på UGA for bruk av hans stereotaxic utstyr og diskusjoner relatert til metodikken for denne teknikken, og fremme for forskning College forskere (BUER) grunnlaget for deres støtte og vår NIH støtte (NINDS gir R01NS096176-02, R01NS097231-01, og F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
