Om inrättande av musmodeller för Zika Virus-inducerad neurologiska sjukdomar med hjälp av Intracerebral injektion strategier: embryonala, Neonatal och vuxen
Summary
Här beskriver vi en metod för att upprätta en modell av Zika virus-inducerad mikrocefali i musen. Detta protokoll innehåller metoder för embryonala, neonatal och vuxen-scenen intracerebral inympning av zikaviruset.
Abstract
Zikaviruset (ZIKV) är ett flavivirus som för närvarande ingår i Nord-, Central- och Sydamerika. Det är nu fastställt att ZIKV kan orsaka mikrocefali och ytterligare hjärnan avvikelser. Mekanismen bakom patogenesen av ZIKV i hjärnans utveckling är dock fortfarande oklart. Intracerebral kirurgiska metoder används ofta i neurovetenskap forskning på adress frågor om både normala och onormala hjärnans utveckling och hjärnans funktion. Detta protokoll använder klassiskt kirurgiska tekniker och beskriver metoder som tillåter en att modell ZIKV-associerade neurologiska sjukdomar i nervsystemet mus. Medan direkt hjärnan inympning inte modell normalläge virus överföring, tillåter metoden utredarna att ställa riktade frågor om följden efter ZIKV infektion i hjärnans utveckling. Det här protokollet beskriver embryonala, neonatal och vuxna stadier av intraventrikulär inokulering av ZIKV. När behärskar, kan denna metod blir en okomplicerad och reproducerbara teknik som bara tar några timmar att utföra.
Introduction
Mikrocefali är ett tillstånd som följd av defekt hjärnans utveckling kännetecknas av mindre än genomsnittliga huvud storlek hos nyfödda. Barn med mikrocefali uppvisar ett spektrum av symtom som kan inkludera utvecklingsförsening, beslag, intellektuella funktionshinder, hörselnedsättning, synproblem och problem med rörlighet och balans, bland annat beroende på sjukdomens svårighetsgrad och orsaka1,2,3. Detta tillstånd är multifaktoriell karaktär, med genetiska, infektiösa agent, och miljömässiga faktorer kopplade till orsakar mikrocefali4,5,6,7,8, 9. Innan 2015-2016 ZIKV utbrott, hade 8 barn ur 10 000 födslar diagnosen mikrocefali i USA enligt CDC10. På februari 1st 2016 WHO deklarerade zikaviruset en nödsituation av internationella folkhälsoproblem på grund av den alarmerande ökningen mikrocefali diagnoser ZIKV infektioner i mödrar11, med 12. En färsk studie från CDC på ZIKV fall i USA tyder på att moderns ZIKV infektion resultat i en 20-fold ökad risk för ett barn att utveckla mikrocefali jämfört med icke-infekterade individer och 4% av ZIKV infekterade mödrar från USA har resulterat i barn med mikrocefali11. Graden av mikrocefali-associerade missbildningar under graviditeten från ZIKV infektion i Brasilien har rapporterats ha påverkat upp till 17% av spädbarn i infekterade mödrar, som anger att andra faktorer i Latinamerika kan bidra till den ökade risken 13. även om vi vet att ZIKV kan orsaka mikrocefali och patogenes i neurala stamceller cell (NPC) befolkningen7,8,14, komplett patogenesen av ZIKV i utvecklingsländerna hjärnan förblir svårfångade. Det är viktigt att utveckla djurmodeller för att ytterligare undersöka sjukdomsmekanismerna bakom hjärnan avvikelser förknippas med ZIKV-infektion.
För att direkt studera den effekt som ZIKV har på hjärnans utveckling, utvecklade vi först en musmodell med intracerebral inympning av embryonala dag 14,5 (E14.5) hjärnan med ZIKV7. Detta skede valdes eftersom det anses representativt av i slutet av första trimestern i mänskliga dräktigheten14. Valpar kan överleva upp till postnatal dag 5 (P5) med detta embryonala intracerebral injektion metod (~ 1 µL 1,7 x 106 vävnad infektiös dos i cellkultur (TCID50/mL)). Dessa postnatal pups uppvisar en rad fenotyper likaså observerats i infekterade mänskliga spädbarn inklusive förstorade ventriklar, neuronala förlust, axonal förtunning, astrogliosis och mikrogliala aktiveringen12,15. En nyfödd mus hjärnan är relativt omogen, besläktad med utvecklingsstadiet av den mänskliga hjärnan halva dräktigheten16, och mus hjärnans utveckling inkluderar en postnatal huvudkomponent. För att studera senare dräktighet scenen infektioner, beskrivs också en metod för postnatal infektion. Nyfödda infekterade med ZIKV på P1 kan överleva upp till 13 dagar efter injektion. Blod-född adult Stadium infektion har beskrivits i musen tidigare17 men kräver användning av interferon (IFN) reglerande faktor (IRF) transkription faktorer IRF-3, -5-7 trippel knockout stam. Det här protokollet beskriver en metod för ympning ZIKV intraventrikulärt för att kringgå inaktivera antivirala responsen av murina modellen i vuxen. Medan detta kringgår murina immunsystemet, härma denna administreringsväg injektion inte direkt den typiska rutten av infektion. För att åtgärda denna diskrepans direkt, kan försöksledaren utföra en intrauterin infektion i ZIKV istället för intrakraniell rutten. Antagna från tidigare arbete18, har vi kortfattat denna teknik i detta embryonala infektion protokoll.
Den Zika virusstammar genomförs med denna teknik inkluderar isolatet av mexikanska MEX1-447,19 och i Afrika isolera herr-766 isolerade i 194720. Zika MEX1-44 var isolerad i Chiapas, Mexiko i januari 2016 från en infekterad Aedes aegypti mygga. Vi fick detta virus med behörighet via den University of Texas Medical branschen i Galveston (CD). Dessutom var den denguefeber virus serotypen 2 (DENV2) inokuleras med denna teknik i en jämförande studie. DENV2, stam S16803 (sekvens GenBank GU289914), isolerades från ett patientprov från Thailand 1974 och anpassade i C6/36 celler. Viruset var överförda två gånger i Vero-celler genom World Reference Center för framväxande virus och Arboviruses (WRCEVA) innan musen injektioner. Detta visar att denna teknik fungerar lika bra för olika stammar av ZIKV och andra flavivirus som kan ha en inverkan på hjärnans utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs här är en metod för intracerebral inympning av ZIKV på embryonala, neonatal och vuxna stadier för utredning av ZIKV-inducerade skador i hjärnans utveckling. Medan enkla, finns det några överväganden som utredare bör vidta för att säkerställa kvaliteten på studien och säkerheten för de inblandade.
DENV är närbesläktad med ZIKV i släktet flavivirus. DENV har inte länkats causally med pediatrisk hjärnstörningar hos människor. DENV2 kan infektera och replikera i hj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Dr Abdellatif Benraiss vid University of Rochester för sitt mentorskap och diskussioner relevant för lära sig vuxen kirurgiska och nyfödda tekniker. Författarna vill även berömma Dr James Lauderdale på UGA för användning av hans stereotaxic utrustning och diskussioner relaterade till ställa in metoden för denna teknik, och befordran för forskning College forskare (bågar) foundation för deras och våra NIH stöd (NINDS bidrag R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01).
Materials
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | – | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | – | |
| Mineral Oil | VWR | – | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
