Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Summary

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Abstract

Core cellulaire processen zoals DNA-replicatie en segregatie, eiwitsynthese celwand biosynthese en celdeling, is afhankelijk van de functie van eiwitten die essentieel voor bacteriële overleven zijn. Een aantal doelgroepen gerichte kleurstoffen kan als sondes beter deze processen begrijpen worden gebruikt. Kleuring met lipofiele kleurstoffen kan de observatie van de membraan structuur, visualisatie van lipide-microdomains, en detectie van membraan blebs. Gebruik van TL-d-aminozuren (FDAAs) om de sites van peptidoglycaan biosynthese sonde kan duiden op mogelijke gebreken in de celwand biogenese of cel groei patronen. Ten slotte kunnen nucleïnezuur vlekken aangeven mogelijke defecten in DNA replicatie of chromosoom segregatie. Cyanine DNA vlekken label levende cellen en zijn geschikt voor time-lapse microscopie real-time waarnemingen van nucleoïde morfologie inschakelen tijdens celgroei. Protocollen voor het labelen van de cel kunnen worden toegepast op eiwit uitputting mutanten te identificeren van de gebreken in de membraan structuur, celwand biogenese of chromosoom segregatie. Bovendien kan time-lapse microscopie worden gebruikt om te controleren van morfologische veranderingen zoals een essentieel eiwit wordt verwijderd en extra verwerven in eiwitfunctie inzicht kan. Bijvoorbeeld, resulteert de uitputting van essentiële celdeling eiwitten in filamentation of vertakking, overwegende dat de uitputting van de cel groei eiwitten cellen tot kortere of ronder kan veroorzaken. Protocollen voor celgroei doelgroepen gerichte labeling en time-lapse microscopie vindt u hier, voor de bacteriële plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Samen, doelgroepen gerichte kleurstoffen en time-lapse microscopie inschakelen karakterisering van essentiële processen in A. tumefaciens. Tot slot, de protocollen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor sonde essentiële processen in andere bacteriën.

Introduction

Progressie door de bacteriële cel cyclus moet de coördinatie van de vele processen met inbegrip membraan en een celwand biosynthese, DNA-replicatie en segregatie en celdeling. Om volledig te begrijpen de complexiteit van de bacteriële celbiologie, is het noodzakelijk om te studeren van deze essentiële activiteiten; Dit is echter een niet-triviale taak omdat de levensvatbaarheid van de cellen in het gedrang komt wanneer essentiële onderdelen van deze trajecten zijn mutagenized. Epifluorescence microscopie in combinatie met doelgroepen gerichte kleurstoffen is een krachtige aanpak van deze essentiële processen in wildtype en mutant bacteriestammen sonde.

Peptidoglycaan-specifieke kleurstoffen zijn fluorescerende antibiotica (vancomycine-FL, bocillin-FL) en TL-d-aminozuren (bijvoorbeeld. 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid-3-amino-d-alanine, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanine , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanine; TADA). Bij gram-positieve bacteriën, het gebruik van subletale concentraties van fluorescerend antibioticum analogen sonde sites van peptidoglycaan biosynthese heeft een effectieve strategie geweest om te onthullen peptidoglycaan invoeging patronen^{1,2, 3,4}. Terwijl inzichten te krijgen in het peptidoglycaan invoeging patronen in vaste gram-negatieve bacteriën⁵TL vancomycine labeling is gebruikt, geeft de buitenmembraan in het algemeen een permeabiliteit barrière die voorkomt het gebruik van TL dat antibiotica als een sonde voor peptidoglycaan biosynthese in levende cellen. In tegenstelling, label korte pulsen van TL-d-aminozuren of d-aminozuren met biorthogonal functionele groepen covalent regio’s van recente peptidoglycaan opneming in een breed scala van levende bacteriecellen^6,7. Patronen van peptidoglycaan invoegen die zijn waargenomen met synthetische d-aminozuren bevatten punctate en septal (Escherichia coli en Bacillus subtilis), polaire en septal (Agrobacterium tumefaciens en Listeria monocytogenes), septal enige (Staphylococcus aureus) en apicaal (Streptomyces venezuelae)^6,7. Deze opmerkingen aangeven dat bacteriën uiteenlopende patronen van biogenese van de celwand vertonen en dat het gebruik van synthetische d-aminozuren als sondes voor de behandeling van de groei patronen een kostbare strategie in veel bacteriën is.

Kleurstoffen die label bacteriële chromosomen bevatten de deoxyribonucleic acid (DNA) specifieke kleine groef binder (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) en hoge affiniteit cyanine kleurstoffen (groen en oranje; overzicht van de materialen). DAPI kleuring van vaste cellen helpt in opsomming van bacteriën van milieu monsters⁸, terwijl DAPI kleuring van levende cellen wordt gebruikt om aan te geven van bacteriële levensvatbaarheid⁹. In tegenstelling, kleurstoffen cyanine zoals oranje en groen worden vaak beschreven als de impermeant “dode” cel membraan vlekken bij het inventariseren van niet-levensvatbare cellen⁹. Opmerkelijk is wanneer deze reagentia worden gebruikt om de morfologie van het bacteriële nucleoïde tijdens de celgroei sonde, waren DAPI, oranje en groen alle aangetoond membraan permeant en geschikt voor het labelen van levende cellen¹⁰. In levende cellen van de E. coli , diffuus als gevolg van auto-fluorescentie DAPI kleuring van DNA blijkt uit het cytoplasma en herhaalde blootstelling aan DAPI gebeitste cellen aan het ultraviolette (UV) licht ten de nucleoïde structuur¹⁰. Kleuring van E. coli of B. subtilis met oranje blijkt dat deze kleurstof membraan permeant is en langdurige fluorescentie op bindende aan DNA in levende cellen biedt zonder de beïnvloedende celgroei, DNA-replicatie of chromosoom segregatie¹⁰ . Deze opmerkingen suggereren dat cyanine DNA kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bewaken van de morfologie van nucleoids tijdens de celgroei bij vele bacteriën.

Phospholipid-specific stryl kleurstoffen zoals N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; Zie materialen lijst) kationogene stoffen zijn en bij voorkeur associëren met negatief geladen fosfolipiden zoals cardiolipin en phosphatidylglycerol¹¹. Verschillende patronen worden waargenomen wanneer 4-64 wordt gebruikt voor het label van de membraan van verschillende bacteriën. Bij Escherichia coli, 4-64 is verrijkt met de palen, in banden langs de laterale muur, en in de divisie sites laat pre-divisional cellen¹². Bacillus subtiliskunt 4-64 labelen de visualisatie van lipide spiralen¹³. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiketten de buitenmembraan en wordt waargenomen in een patroon van de karakteristieke “hoefijzer” waarin de groei paal is verstoken van labeling^14,15. Deze opmerkingen geven aan dat deze bacteriën vertonen heterogene lipide distributies als gevolg van de aanwezigheid van lipide-domeinen die tot cellulaire asymmetrie bijdragen. Veranderingen in 4-64 labeling patronen zoals de aanwezigheid van diffuse labeling, blebs of blaasjes, invaginations of krimp van het membraan kan worden informatieve in karakterisering van mutanten die van invloed zijn de distributie of de biosynthese van lipiden.

Verder dan kleuring cellen, is de functie van eiwitten deelnemen aan essentiële processen bepalen nodig. De karakterisering van essentiële eiwitten is technisch uitdagend, want het is niet mogelijk om te verwijderen van essentiële genen en de fenotypische gevolgen bestuderen. Dus, alternatieve benaderingen die de eiwitten afbreken naar voren zijn gekomen. Bijvoorbeeld, kan een essentiële gen worden gebracht onder de controle van een afleidbare promotor in plaats van zijn eigen promotor. Afleidbare initiatiefnemers zijn inspelen op kleine molecules zoals; ¹⁶, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21}, arabinose²², vanillate^17,23, van zink xylose²³, dus de transcriptie van het target-gen ophoudt en de proteïne van belang is uitgeput wanneer de inductor wordt verwijderd. Alternatieve benaderingen voor het afbreken van essentiële eiwitten van belang omvatten synthetische riboswitches²⁴ die kleine molecuul-RNA interacties kunt belemmeren transcriptie van doelgenen, CRISPR interferentie^25,26 naar blok transcriptie van doelgenen en afleidbare eiwit afbraak^27,28 die gebruikmaakt van peptide tags aan target eiwitten voor aantasting door het ClpXP protease. Uitputting stammen bieden slechts een korte tijd voor karakterisering voordat de cellen verliezen levensvatbaarheid, microscopische beeldvorming van cellen na verloop van tijd tijdens eiwit uitputting is daarom een krachtige aanpak voor karakterisering. Inderdaad, microscopie van levende bacteriecellen onderzoekers inzichten te krijgen in de fundamentele biologische processen, met inbegrip van de mechanismen van de cel vorm onderhoud, secretie en compartimentering²⁹in staat heeft gesteld.

A. tumefaciens is een bacteriële plant pathogen³⁰ en natuurlijke genetische ingenieur^31,32. Dus, mechanismen met betrekking tot pathogeniteit, inbegrepen, gastheer-pathogeen interacties^33,34,35, secretie³⁶en host transformatie^{30,31, 37} uitgebreid zijn onderzocht. Voor het ontwerpen van strategieën die A. tumefaciens gemedieerde ziekte te voorkomen of te verbeteren plant transformatie, moeten de processen essentieel voor overleving van A. tumefaciens beter worden begrepen. Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen en de recente ontwikkeling van een strategie van de uitputting eiwit voor A. tumefaciens¹⁸ biedt een manier om te onderzoeken van essentiële processen.

Hier vindt u gedetailleerde protocollen voor microscopische analyse van wildtype, mutant en eiwit uitputting stammen van A. tumefaciens . De eerste twee protocollen beschrijven hoe te bereiden cellen en hen label met doelgroepen gerichte kleurstoffen. Het derde protocol biedt stapsgewijze aanwijzingen voor agarose pads (Figuur 1) voorbereiding en beeldvorming van de bacteriële cellen (Figuur 2, Figuur 3, , Figuur 4). Deze protocollen mogelijk ook geschikt voor andere bacteriën met extra aanpassingen ter verantwoording voor verschillende media voorwaarden, groeicijfers, zuurstof eisen en structuren van de cel.

Protocol

1. groei van A. tumefaciens stammen A. tumefaciens stammen kweken Gebruik een steriele houten stok of Pipetteer tip om te enten met een één kolonie van de gewenste stam 1 mL van ATGN groei media (zie lijst van de materialen voor het recept).Opmerking: Voor A. tumefaciens uitputting stammen, moet de ATGN 1 mM IPTG bevatten als een inductor te handhaven van de biosynthese van het essentiële eiwit. Groeien de A. tumefaciens stammen o…

Representative Results

Doel-specifieke etikettering van wildtype A. tumefaciens cellenOm te illustreren dat cel morfologie wordt niet beïnvloed door het wassen stappen of behandeling met 1% DMSO (die wordt gebruikt voor het verdunnen van de fluorescente kleurstoffen), cellen werden beeld rechtstreeks vanuit cultuur (figuur 2A, uiterst linkse paneel), na het wassen van de cellen door centrifugeren zoals beschreven in …

Discussion

Dit protocol bevat een reeks procedures voor het onderzoek van A. tumefaciens wildtype, mutant en uitputting stammen. Het is vermeldenswaard dat alle procedures vermeld in de sectie protocol gemakkelijk aangepast voor andere bacteriestammen met extra wijzigingen worden kan ter verantwoording voor groei media, temperaturen en groeicijfers.

Het gebruik van doelgroepen gerichte kleurstoffen is een waardevol instrument voor het verstrekken van een gedetailleerde karakterisering van celcyc…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.