라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Summary

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

Abstract

세균의 생존에 필수적인 단백질의 기능에 의존 하는 DNA 복제 및 분리, 단백질 합성, 세포 벽 생 합성 및 세포 분열 등의 핵심 세포 프로세스. 이러한 프로세스를 이해 하는 더 나은 프로브로 대상 특정 염료의 시리즈를 사용할 수 있습니다. 닥터지 염료와 염색 법 막 구조 관찰, 지질 microdomains의 시각화 및 막 blebs의 감지 수 있습니다. 형광-d-아미노산 생 합성 peptidoglycan의 사이트를 조사 하는 (FDAAs)의 사용은 세포 벽 속 또는 셀 성장 패턴에 잠재적인 결함을 나타낼 수 있습니다. 마지막으로, 핵 산 얼룩 DNA 복제 또는 염색체 분리 가능한 결함을 나타낼 수 있습니다. Cyanine DNA 레이블 셀 생활 얼룩 되며 시간 경과 현미경 세포 성장 동안 핵양체 형태학의 실시간 관측을 사용에 적합 합니다. 막 구조, 세포 벽 속, 또는 염색체 분리에 결함을 식별 하기 위해 단백질 소모 돌연변이에 셀 라벨에 대 한 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 모니터 형태학 상 변화는 필수적인 단백질 제거 되 고 단백질 기능에 대 한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 예를 들어 필수 세포 분열 단백질의 고갈 결과 filamentation 또는 분기, 반면 세포 성장 단백질의 고갈 짧은 또는 둥글게 되는 셀을 발생할 수 있습니다. 여기, 세포 성장, 특정 대상 레이블 및 시간 경과 현미경 검사 법 프로토콜 Agrobacterium tumefaciens세균성 식물 병원 체에 대 한 제공 됩니다. 대상 특정 염료 및 시간 경과 현미경에 필수적인 프로세스의 특성을 사용 하는 함께, A. tumefaciens. 마지막으로, 제공 하는 프로토콜 프로브 다른 박테리아에 필수적인 프로세스를 쉽게 수정할 수 있습니다.

Introduction

세균성 세포 주기 진행, 막과 세포 벽 생 합성, 분리, DNA 복제와 세포 분열을 포함 하 여 많은 프로세스의 필요 합니다. 완벽 하 게 이해 하려면 세균성 세포 생물학의 복잡성, 그것은 이러한 필수 이벤트; 공부 하는 데 필요한 그러나이 통로의 주요 구성 요소는 mutagenized 때 세포 생존 능력은 손상 이후,이 아닌-사소한 작업입니다. 대상 특정 염료와 결합 하는 Epifluorescence 현미경 wildtype 및 돌연변이 세균성 긴장에 필수적인 프로세스를 조사 하는 강력한 접근 이다.

Peptidoglycan 특정 염료 등 형광-d-아미노산 (예를 들어 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic 산-3-아미노-d-알라닌, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-알라닌이 형광 항생제 (vancomycin-플로리다, bocillin-FL) 나 다; tetramethylrhodamine-3-아미노-d-알라닌; 여 깄 어 요)입니다. 그람 양성 세균에 peptidoglycan 생 합성의 사이트를 조사 하에 형광 항생제 아날로그의 sublethal 농도 사용 하 여 공개 peptidoglycan 삽입 패턴^{1,2, 효과적인 전략 되었습니다. 3,4}. 형광 vancomycin 라벨 삽입 패턴 고정 된 그람 음성 박테리아⁵는 peptidoglycan에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 되었습니다, 하는 동안 외부 막 일반적으로 형광의 사용을 방지 하는 침투성 방 벽을 제공 라이브 셀에 peptidoglycan 생 합성에 대 한 조사로 항생제. 반면, 형광-d-아미노산 또는 d-아미노산 biorthogonal 기능 그룹의 짧은 펄스 covalently 살아있는 세균성 세포^6,7의 넓은 범위에 최근 peptidoglycan 삽입의 레이블. 합성 d-아미노산으로 관찰 된 peptidoglycan 삽입의 패턴 등이 punctate septal (대장균 및 새 균의 subtilis), 극 지와 septal (Agrobacterium tumefaciens 및 Listeria monocytogenes), septal만 (황색 포도상구균), 그리고 꼭대기 (Streptomyces venezuelae)^6,7. 이러한 관측 나타냅니다 박테리아 세포 벽 속의 다양 한 패턴을 전시 하 고 합성 d-아미노산 성장 패턴을 조사 하기 위한 조사로의 사용은 많은 박테리아에 귀중 한 전략 이다.

세균 염색체 분류 염료 포함 deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 작은 강 저 바인더 (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI)와 높은 선호도 cyanine 염료 (녹색 및 오렌지; 자료 목록 참조). 고정된 셀의 얼룩 DAPI DAPI 라이브 셀의 얼룩은 세균 생존⁹를 나타내는 데 사용 하는 반면 환경 샘플⁸, 박테리아의 열거 지원 합니다. 반면, cyanine 염료와 같은 오렌지와 녹색 자주 설명으로 막 impermeant “죽은” 셀 비 가능한 셀⁹열거 하 얼룩. 놀랍게도, 이러한 시 약은 세포 성장 하는 동안 세균의 핵양체의 형태를 조사 하는 데 사용 됩니다, DAPI, 주황색과 녹색 했다 모든 표시 막 permeant 고 라이브 셀¹⁰라벨의 것. 대장균 세포 살고, DAPI DNA의 얼룩 때문에 자동 형광 확산 세포질에서 나타나고 DAPI 스테인드 셀의 자외선 (UV)에 반복된 노출 perturbs 핵양체 구조¹⁰. 얼룩 대장균 또는 오렌지와 B. subtilis 밝혀이 염료 permeant 막 이며, 세포 성장, DNA 복제, 또는 염색체 분리^{10 영향을 주지 않고 라이브 세포에서 dna 바인딩 시 오랫동안 형광을 제공} . 이러한 관측 cyanine DNA 염료 많은 박테리아의 세포 성장 하는 동안 nucleoids의 형태를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것이 좋습니다.

Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) 페 닐 등 염료) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; 참조 자료 목록) 양이온 화합물 및 부정 청구와 우선적으로 연결 인지질 cardiolipin 및 phosphatidylglycerol¹¹등. 독특한 패턴 4-64 다른 박테리아의 멤브레인을 사용 하는 경우 관찰 된다. 대장균, 4-64 측면 벽을 따라 밴드에 폴란드에서 농축 하 고 부서 사이트의 pre-divisional에서¹²세포. 새 균의 subtilis에서 4-64 라벨 지질 나선¹³의 시각화 수 있습니다. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 레이블 외부 막 하 고 있는 성장 극은^14,15라벨 없는 특성 “편 자” 패턴에서 관찰 됩니다. 이러한 관찰이이 박테리아 세포 비대칭을 지질 도메인의 존재로 인해 다른 유형의 지질 배포판을 나타납니다. 4-64 확산 라벨의 존재와 같은 표시 패턴의 변화, blebs 또는 소포, invaginations, 또는 막 수축 수 있습니다 배포 또는 지질 생 합성에 영향을 주는 돌연변이 특성화에 유익.

세포를 얼룩이 지기, 넘어 필수 프로세스에 참여 하는 단백질의 기능을 결정은 필요 합니다. 필수 단백질의 특성은 필수 유전자를 삭제 하는 phenotypic 결과 공부 불가능 하기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 따라서, 단백질을 고갈 다른 방법 등장 했습니다. 예를 들어 필수 유전자의 네이티브 발기인 보다는 유도할 수 있는 발기인의 컨트롤 아래 놓일 수 있다. 유도할 수 있는 발기인은 반응 작은 분자와 같은; ¹⁶, 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,,1819,20,21}, arabinose²²,²³, vanillate^17,아연 xylose²³, 따라서 대상 유전자의 녹음 방송을 중단 하 고 관심사의 단백질은 유도 제거 될 때 고갈. 필수 단백질의 고갈에 대 한 대체 방법이 포함 합성 riboswitches²⁴ CRISPR 간섭^{25,26 대상 유전자의 전사를 방해 작은 분자 RNA 상호 작용을 사용 하} 대상 유전자의 유도할 수 있는 단백질 저하^27,28 ClpXP 효소에 의해 저하에 대 한 대상 단백질을 펩 티 드 태그를 사용 하 여 블록 전사 하. 따라서, 단백질 소모 하는 동안 시간이 지남에 세포의 현미경 이미징 특성에 대 한 강력한 접근은, 세포 생존 능력을 잃기 전에 고갈 긴장 특성화에 대 한 짧은 시간을 제공 합니다. 실제로, 살아있는 세균성 세포의 현미경 연구원 세포 모양 유지 보수, 분 비, 및 구획²⁹의 메커니즘을 포함 하 여 기본적인 생물 학적 과정에 대 한 통찰력을 얻을 수 있게 되었습니다.

A. tumefaciens 는 세균성 식물 병원 체³⁰ 자연 유전자 엔지니어^31,32입니다. 따라서, 메커니즘 관련 pathogenicity를 포함 한 호스트 병원 체 상호 작용^33,,3435, 분 비³⁶및 호스트 변환^{30,31, 37} 광범위 하 게 조사. A. tumefaciens 중재 질병을 방지 하거나 공장 변환 향상 전략, 디자인에 A. tumefaciens 생존을 위한 필수 프로세스 더 나은 이해를 해야 합니다. 대상 특정 염료를 사용 하 여 A. tumefaciens¹⁸ 단백질 소모 전략의 최근 개발 필수 프로세스를 조사 하는 수단을 제공 합니다.

여기, A. tumefaciens 의 wildtype, 돌연변이, 그리고 단백질 소모 긴장의 미세한 분석에 대 한 상세한 프로토콜 제공 됩니다. 처음 두 개의 프로토콜 셀을 준비 하 고 특정 대상 염료로 레이블을 지정 하는 방법을 설명 합니다. 세 번째 프로토콜 agarose 패드 (그림 1)를 준비 하 고 (그림 2, , 그림 3 그림 4) 세균성 세포 이미징에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 미디어 조건, 성장 속도, 산소 요구 사항 및 셀 구조에 대 한 계정에 추가 적응으로 다른 박테리아에 대 한 적합 한 수도 있습니다.

Protocol

1. A. tumefaciens 긴장의 성장 A. tumefaciens 종자를 배양 메 마른 나무 지팡이 또는 피펫으로 팁을 사용 하 여 원하는 긴장의 단일 식민지와 ATGN 성장 매체 (제조 법에 대 한 자료 목록 참조)의 1 mL를 접종.참고: A. tumefaciens 고갈 변종에 대 한 ATGN는 필수 단백질의 생 합성을 유지 하기 위해 유도로 1mm IPTG를 포함 해야 합니다. A. tumefaciens 긴?…

Representative Results

대상별 wildtype의 라벨 A. tumefaciens 셀그 셀 형태를 설명 하기 위해 영향을 받지 않습니다 세척 단계 또는 (는 형광 염료를 희석 하는 데 사용 됩니다) 1 %DMSO 치료, 세포로 세포 세척 후 문화 (그림 2A, 맨 왼쪽된 패널)에서 직접 몇 군데 있었다 원심 분리 1.2 (그림 2A, 왼쪽된 패널), 또?…

Discussion

이 프로토콜에는 A. tumefaciens wildtype, 돌연변이, 그리고 소모 긴장의 조사에 대 한 절차의 일련을 포함 되어 있습니다. 그것은 프로토콜 섹션에 나열 된 절차의 모든 성장 매체, 온도, 및 성장 속도 대 한 계정에 추가 수정 다른 세균성 긴장에 쉽게 적용할 수 있습니다 지적 가치가 있다.

대상 특정 염료를 사용 하 여 세균성 세포에서 세포 주기 이벤트의 상세한 묘사를 제?…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.