חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Summary

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

Abstract

תהליכים תאיים ליבה כגון שכפול ה-DNA וסגרגציה, סינתזה של חלבון, ביוסינטזה דופן התא, חלוקת התא להסתמך על תפקידו של חלבונים, המהווה מרכיב חיוני להישרדות החיידק. ניתן להשתמש סדרת צבעי במטרה כפי הגששים טוב יותר להבין תהליכים אלה. צביעת עם צבעי lipophilic מאפשר התבוננות מבנה הממברנה, ויזואליזציה של השומנים microdomains, גילוי של קרום מגדלים פורחים. השימוש של חומצות אמינו פלורסנט-d (FDAAs) כדי לחקור את האתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה ניתן לציין פגמים פוטנציאליים להן קיר התא או המתבנת צמיחת תאים. לבסוף, חומצת גרעין כתמי ניתן לציין ליקויים אפשריים-סגרגציה שכפול או כרומוזום ה-DNA. Cyanine DNA כתמי תווית לחיות תאים ומתאימים ל זמן לשגות מיקרוסקופ שמאפשר מתצפיות נוקלאואיד מורפולוגיה של במהלך גדילת התאים. ניתן להחיל פרוטוקולים עבור תיוג התא חלבון המוטנטים דלדול לזהות פגמים מבנה הממברנה, דופן התא להן או כרומוזום סגרגציה. יתר על כן, זמן לשגות מיקרוסקופ ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים כמו חלבון חיוני יוסר ולא יכולה לספק תובנות פונקציה של חלבונים נוספים. לדוגמה, דלדול של חלבונים חיוניים חלוקת התא תוצאות filamentation או הסתעפות, ואילו דלדול של התא צמיחה חלבונים עלול לגרום לתאים להפוך קצר יותר או עגולות. כאן, פרוטוקולים צמיחת תאים, במטרה תיוג של מיקרוסקופיית זמן לשגות ניתנים עבור המחלה חיידקי צמח Agrobacterium tumefaciens. יחד, במטרה צבעי ומיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרים אפיון תהליכים חיוניים ב א tumefaciens. לבסוף, הפרוטוקולים הניתנים ניתן לשנות בקלות כדי לחקור חיוני בתהליכי חיידקים אחרים.

Introduction

התקדמות דרך מחזור התא חיידקית מחייבת התיאום של תהליכים רבים כולל ביוסינטזה ממברנה, דופן התא, שכפול ה-DNA, סגרגציה של חלוקת התא. כדי להבין באופן מלא את המורכבות של ביולוגיה של התא חיידקי, זה הכרחי לחקור אירועים אלה חיוניים; עם זאת, זוהי משימה לא טריוויאלי שכן הכדאיות תא בסכנה כאשר רכיבי מפתח של המסלולים הללו הם mutagenized. מיקרוסקופ Epifluorescence יחד עם צבעי במטרה היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור תהליכים חיוניים אלה wildtype, זני חיידקים מוטנטים.

צבע ספציפי פפטידוגליקן לכלול אנטיביוטיקה פלורסנט (ואנקומיצין-FL, bocillin-FL) וחומצות אמינו פלורסנט-d (לדוגמה: 7-hydroxycoumarin-3-קרבוקסילית חומצה-3-אמינו-d-אלנין, HADA; d 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino–אלנין , נדא; tetramethylrhodamine-3-אמינו-d-אלנין; ג’אר). חיידקים גראם חיוביים, השימוש של ריכוזים לא קטלני של פלורסנט תחליפי אנטיביוטיקה כדי לחקור אתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה כבר אסטרטגיית יעיל כדי לחשוף פפטידוגליקן ההכנסה דפוסי^{1,2, 3,4}. בעוד תיוג פלורסנט ואנקומיצין שימש כדי לקבל תובנות פפטידוגליקן ההכנסה דפוסים קבועים חיידקים גראם שליליים⁵, הממברנה החיצונית בדרך כלל מספק מחסום חדירות שמונעת שימוש פלורסנט אנטיביוטיקה כמו בדיקה של הביוסינתזה פפטידוגליקן בתאים חיים. לעומת זאת, בפולסים של חומצות אמינו פלורסנט-d או חומצות אמינו d עם קבוצות פונקציונליות biorthogonal תווית covalently מחוזות ההכנסה פפטידוגליקן האחרונות במגוון רחב של חיים תאים חיידקיים^6,7. דפוסי פפטידוגליקן ההכנסה שנצפו עם חומצות אמינו d סינתטי כוללים punctate במחיצה הבין-פרוזדורית (Escherichia coli ו- Bacillus subtilis), קוטב ו במחיצה הבין-פרוזדורית (Agrobacterium tumefaciens , ליסטריה), במחיצה הבין-פרוזדורית היחידה (Staphylococcus aureus), הפסגה (Streptomyces venezuelae)^6,7. מקרים אלה מצביעים על חיידקים מפגינים דפוסי מגוונות של דופן התא להן כי השימוש של חומצות אמינו d סינתטיים כמו הגששים לבחינת המתבנת הצמיחה היא אסטרטגיה יקר בחיידקים רבים.

צובעים את תווית כרומוזומים חיידקי כוללים חומצה deoxyribonucleic (DNA) ספציפיים groove קטין הקלסר (4, 6-diamidino-2-phenylindole; דאפי) צובעת cyanine זיקה גבוהה (ירוק וכתום; ראה רשימת חומרים). דאפי צביעת תאים קבוע מסייע ספירה של חיידקים מן הסביבה דגימות⁸, ואילו דאפי מכתים של תאים חיים משמש לציון הכדאיות חיידקי⁹. לעומת זאת, cyanine צבענים כמו כתום וירוק מתוארים לעתים קרובות כמו קרום התא “מת” impermeant כתמי לספור תאים כלכלית⁹. למרבה הפלא, כאשר נוגדנים אלה משמשים כדי לחקור את המורפולוגיה של נוקלאואיד חיידקי במהלך צמיחת תאים, דאפי, כתום וירוק כל הוצגו להיות קרום permeant, ובעל יכולת תיוג תאים חיים¹⁰. E. coli תאים חיים, דאפי צביעה של DNA מופיע ‘ מאטום לשקוף ‘ עקב אוטומטי-זריחה של הציטופלסמה, חשיפות חוזרות ונשנות של תאים שהוכתמו דאפי אור אולטרה סגול (UV) perturbs את מבנה נוקלאואיד¹⁰. E. coli מכתימים או B. subtilis עם תפוז מגלה כי זה צבע ממברנה permeant ומספק לאורך זמן זריחה על הכריכה ל- DNA בתאים חיים מבלי להשפיע על צמיחת תאים, שכפול ה-DNA או סגרגציה כרומוזום¹⁰ . מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש cyanine DNA צבעי לפקח המורפולוגיה של nucleoids במהלך גידול תאים של חיידקים רבים.

Phospholipid-specific stryl צבענים כמו N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) dibromide pyridinium (4-64; ראה רשימה) הם תרכובות cationic ולשייך מעדיפים אניון פוספוליפידים כגון cardiolipin ו- phosphatidylglycerol¹¹. דפוסים ברורים הם נצפו כאשר 4-64 משמש להוספת תווית הקרום של חיידקים שונים. Escherichia coli, 4-64 מועשר בתמציות הפולנים, בלהקות לאורך החומה לרוחב, ולאחר¹²תאים האתרים חטיבת pre-divisional של המנוח. ב. Bacillus subtilis, 4-64 תיוג מאפשר את החזיית השומנים ספירלות¹³. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 תוויות הממברנה החיצונית, הוא ציין תבנית אופיינית “פרסה” שבו הקוטב צמיחה נטול תיוג^14,15. תצפיות אלה מציינים כי חיידקים אלו שהפגינו הפצות השומנים הטרוגנית בשל נוכחותם של השומנים תחומים אשר תורמים אסימטריה הסלולר. שינויים בדפוסי תיוג 4-64, כגון הנוכחות של תיוג ‘ מאטום לשקוף ‘, מגדלים פורחים או שלפוחית, invaginations או הצטמקות קרום יכול להיות אינפורמטיבי באפיון מוטציות להשפיע על ההפצה או ביוסינטזה של ליפידים.

מעבר צביעת תאים, הקובע את הפונקציה של חלבונים המשתתפים בתהליכים חיוניים הכרחי. האפיון של חלבונים חיוניים היא טכנית מאתגר כי זה בלתי אפשרי למחוק גנים חיוניים וללמוד את ההשלכות פנוטיפי. לפיכך, גישות אלטרנטיביות המדלדלים החלבון הופיעו. לדוגמה, ניתן לשים על גנים חיוניים תחת השליטה של יזם inducible ולא יזם מקורי שלה. היזמים inducible הם מגיבים מולקולות קטנות כגון; אבץ vanillate^17,23, אראבינוז²², איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)^{17,18,19,20,21},¹⁶ xylose²³, ובכך שעתוק של הגן היעד מפסיק, החלבון עניין תיגמר כאשר משרן מוסר. גישות חלופיות עבור depleting חלבונים חיוניים עניין כוללים riboswitches סינתטי²⁴ אשר השתמש מולקולה קטנה-RNA אינטראקציות לעכב שעתוק של גנים היעד, CRISPR הפרעות^25,26 כדי לחסום שעתוק של גנים היעד, חלבון inducible השפלה^27,28 אשר משתמש בתגי פפטיד חלבונים היעד עבור השפלה על ידי פרוטאז ClpXP. דלדול זנים לספק זמן קצר בלבד עבור אפיון לפני התאים מאבד הכדאיות, לכן, הדמיה מיקרוסקופי של תאים לאורך זמן במהלך דלדול חלבון היא גישה רב-עוצמה עבור אפיון. אכן, מיקרוסקופיה של תאים חיידקיים חי איפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, כולל את המנגנונים של תחזוקה צורת התא, הפרשת מידור²⁹.

Tumefaciens א הוא פתוגן חיידקי הצמח³⁰ ,^31,טבעי המהנדס הגנטי³². לפיכך, מנגנונים הקשורים פתוגניות, לרבות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות^33,34,35, הפרשת³⁶מארח טרנספורמציה^{30,31, 37} נחקרו בהרחבה. לתכנן אסטרטגיות במניעת מחלות tumefaciens א מתווכת או לשפר את הצמח טרנספורמציה, תהליכים חיוניים להישרדות tumefaciens א צריך להיות מובן יותר. השימוש של צבעי במטרה ופיתוח אסטרטגיה דלדול חלבון tumefaciens א¹⁸ האחרונות מספק אמצעים כדי לחקור תהליכים חיוניים.

. הנה, פרוטוקולים מפורט לבדיקה מיקרוסקופית wildtype מוטציה, חלבון דלדול זנים של tumefaciens א הינם מסופקים. הפרוטוקולים שני הראשונים מתארים כיצד להכין תאים, התווית אותם עם צבע במטרה. הפרוטוקול השלישי מספק הנחיות צעד אחר צעד עבור הכנת agarose רפידות (איור 1) והדמיה של תאים חיידקיים (איור 2, איור 3, איור 4). פרוטוקולים אלה יכול להיות גם מתאים חיידקים אחרים עם עיבודים נוספים לקחת בחשבון תנאים מדיה שונים, שיעורי צמיחה, דרישות החמצן של מבנה התא.

Protocol

1. צמיחה של זנים tumefaciens א Culturing זנים tumefaciens א השתמש עצה מקל או pipet עץ סטרילי כדי לחסן 1 מ”ל של צמיחה ATGN מדיה (ראה רשימת חומרים על המתכון) עם מושבה בודדת של המתח הרצוי.הערה: עבור זנים דלדול א tumefaciens , ATGN צריכה להכיל 1 מ”מ IPTG כמו משרן כדי לשמור על ביוסינטזה של החלבו…

Representative Results

במטרה תיוג של wildtype א tumefaciens תאיםכדי להמחיש את המורפולוגיה תא לא מושפע על ידי שטיפת מדרגות או טיפול עם 1% דימתיל סולפוקסיד (אשר נמצא בשימוש כדי לדלל את צבעי פלורסנט), התאים היו עם תמונה ישירות מתרבות (איור 2 א, לוח השמאלי), לא?…

Discussion

פרוטוקול זה מכיל סדרה של הליכי החקירה של זנים wildtype מוטציה, דלדול tumefaciens א . ראוי לציין כי כל הנהלים המפורטים בסעיף פרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות זני חיידקים אחרים עם שינויים נוספים חשבון צמיחה מדיה, טמפרטורות של שיעורי צמיחה.

השימוש של צבעי במטרה הוא כלי רב ערך עבור מת?…

Materials

Bacterial Strains
Agrobacterium tumefaciens C58	ATCC	33970	Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA			Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Components
ATGN Minimal Medium			To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.
20X AT Buffer			Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.
NaOH	Fisher BioReagents	BP359
KH2PO4	Fisher Chemical	P288
20X AT Salts			Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave.
(NH4)2SO4	Fisher Chemical	A701
MgSO4•7H2O	Fisher BioReagents	BP213
CaCl2•2H2O	Fisher BioReagents	BP510
MnSO4•H2O	Fisher Chemical	M114
Glucose	Fisher Chemical	D16	Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.
Bacto Agar	Fisher BioReagents	BP1423	Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Optional Media Additives
Kanamycin	GoldBio	K-120	Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml.
IPTG	GoldBio	I2481C5	Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy Materials
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550D	25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-B	22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.
Sparkle Glass Cleaner	Home Depot	203261385	Ammonia and alcohol free.
Ultra Pure Agarose	Invitrogen	16500-100	Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C
PBS	Fisher BioReagents	BP399500	10X solution to be diluted to 1X with sterile water.
Parafilm	Bemis	PM-999	Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.
VALAP			Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.
Lanolin Butter	SAAQIN	SQ-LAB-R1
Petroleum Jelly	Target Corp.	06-17644
Paraffin Wax	Crafty Candles	263012
Name	Company	Catalog Number	Comments
Target-specific dyes
DMSO	Fisher BioReagents	BP231-1	Use to dilute stock solutions of dyes as needed.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)			FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.
DAPI	ThermoFisher Scientific	62247	Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S11368	Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM.
FM4-64	Invitrogen	T3166	Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Dry bath	Sheldon Manufacturing, Inc.	52120-200
Metallic thermal beads	Lab Armor	42370-002
Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera			Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.